Preparation and Applications of Thermo- Responsive Copolymers as a Smart Drug Delivery System

국문 초록 (Abstract)

Part I-A

본 연구는 N-isopropyl acryl amide(NIPPAm)과 1-butyl-3-vinylimidazolium bromide([BVIm]Br)를 라디칼 중합방법에 의하여 부분적 양전하를 갖는 온도 감응성 공중합체를 합성하였다. 합성 된 공중합체들의 NIPAAm 단량체와 BVIm 단량체의 몰비는 95:5, 90:10, 85:15 그리고 80:20으로 각각 합성되었다. 각각 다른 농도의 imidazolium moiety의 존재를 1H NMR을 통하여 확인하였다. 합성된 공중합체의 LCST (저임계 상전이 온도; lower critical solution temperature) 수치는 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 확인 하였으며 imidazolium moiety의 농도가 증가함에 따라 LCST 수치 또한 증가함을 확인 하였다. 또한 imidazolium moiety의 농도가 증가는 수용액 상태에서 미셸표면 전하의 증가를 (+3.4 에서 +21.3 mV, pH 7) 나타냈고 상온에서의 미셸 사이즈의 증가를 보였다. 변화 된 미셸 사이즈의 차이는 25 ~ 50 oC의 온도 범위에서 211.5 에서 69.1 그리고 325.4 에서 171.2 nm로 각각 나타났다.
이러한 결과들은 열감응성 고분자의 LCST 값을 단지 imidazolium unit (BVIm)의 농도로 조절 가능함을 보였다. 더 나아가서, 합성 된 p-NIBIm10과 15은 고정적인 양전하를 갖고 있으며, 정상과 병변부위의 온도 변화 범위인 37 ~ 40oC에서 작용 가능한 고분자 물질로써 지능형 약물 또는 유전자 전달체로의 응용 가능성이 높다고 판단된다.

Part I-B

본 연구에서는 다양한 LCST 값을 갖는 이온성 열감응 공중합체를 합성하였고, 다양한 LCST 값은 음이온의 종류에 따라 조절되었다. 합성된 공중합체는 이온성 부위인 imidazolium moiety를 갖고 있는 poly(NIPAAm-co-BVIm), [p-NIBIm]+[Br]-이며 이를 기반으로 짝이온을 변화시킴으로써 [p-NIBIm]+[X]- (X = Cl, AcO, HCO3, BF4, CF3SO3, PF6, SbF6)을 생성시켰다. 생성 된 공중합체의 화학적 특성은 nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), Fourier-transform infrared (FT-IR), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), 그리고 thermogravimetric analysis (TGA)을 통해 분석하였다. 또한, 다양한 LCST값, 미셸 크기, 그리고 표면 전하를 Ultraviolet-visible spectrophotometer와 Zeta (ξ) sizer를 이용하여 측정 하였으며, LCST 값은 39oC에서 52 oC까지 넓은 영역에 걸쳐 나타났다. 표면 전하 수치인 Zeta (ξ) potential 값은 pH = 7 에서[p-NIBIm]+[X]- (X = Cl . Br)는 +9.7 mV 값을 보였으며, +2.0 mV for [p-NIBIm]+[X]- (X = PF6 . SbF6)는 감소 된 +2.0 mV의 값을 보였다. 미셸 크기의 변화는 서로 다른 음이온의 종류에 따라 [p-NIBIm]+[Br]-; 181.2 nm (또는 2.49 × 10-17cm3) 에서 [p-NIBIm]+[CF3SO3]-; 229.2 nm (또는 5.04 × 10-17cm3) 로 증가함을 보였다.
이결과는 온도에 따른 미셸의 크기 감소의 값은 음이온의 종류에 따라 확연한 차이를 보였다. 본 연구에서의 가장 중요한 사실은 본 열감응성 고분자의 물리화학적 특성이 (LCST, 미셸 사이즈, 그리고 표면 전하등) 음이온을 변화시킴으로써 조절 가능 하다는 점이다. 이러한 특성은 본 열감응성 고분자가 지능형 약물 전달체로의 응용이 가능하다고 판단되는 점이다.

Part II

최근에는 소장 (또는 대장)을 목표로 한 특이적 약물 전달 시스템의 치료 효율을 극대화하고 부작용을 줄이기 위한 연구가 크게 증가하고 있다. 그러나, 인간 창자의 복잡한 환경에 대한 요구를 충족하는 예는 소수에 불과했다. 본 연구에서는 염기성 pH와 온도에 감응하는 공중합체를 합성 하였고, 합성된 공중합체가 pH 1-8의 범위, 그리고 온도 25-42 oC 범위에서의 약물 전달 기능에 대한 특성을 in vitro 상에서 확인 하였다.
염기성 공중합체는 N-isopropylacrylamide (NIPAAm)과 N-vinylimidazole (VIm)의 라디칼 중합 방법으로 합성 되었다. 15 mol%의 염기성 VIm 유닛을 갖는 합성된 공중합체는 (p-NIVIm) pH=7에서 +9.1 mV 표면 전하를 나타냈으며, ~1.0의 낮은 pH인 위장의 pH 범위에서 36.5-42 oC의 높은 LCST를 보였고, ~8.0의 소장 또는 대장의 pH 범위에서는 35.8-38.2 oC의 LCST를 보였다. pH/온도에 의존하는 미셸 구조의 형태와 크기 변화는 건조 또는 습윤 상태에서 SEM과 ZetaSizer를 이용해 확인하였다.
모델 단백질을 (BSA) 이용하여 신체 조건인 37 oC 그리고 pH 1-8 범위에서 저장 및 방출을 확인 하였다. p-NIVIm의 37 oC/pH 1에서의 약물 저장 능력 (LC)와 저장 효율 (LE)은 각각 공중합체 1 mg 당 0.231 mg 그리고 92.4%였다. 상기 약물 전달체는 낮은 pH 값인 1에서 느린 약물 방출을 보였으며(~0.084 mg; ~35 %), 높은 pH 값이 8에서는 순간적인 약물 방출을 보였다(~0.177 mg; ~73%). 합성 된 pH 감응성 단백질 저장/방출 특성은 새로운 소장 (또는 대장)에 특이적으로 약물을 전달 할 수 있는 재료로 응용할 수 있을 것이다.

Part III

본 연구에서는 이상적인 약물 전달체를 mesoporous silica nanoparticle (MSN) 표면에 1-butyl-3-vinyl imidazolium bromide (BVIm)와 N-isopropyl acrylamide (NIPAAm)을 이용하여 공중합체를 형성 시켰다. 표면을 코팅하고 있는 공중합체 (poly(NIPAAm-co-BVIm) (p-NIBIm))의 두께는 2.5 nm와 5 nm 범위에서 조절 되었고, 이는 반응액에서의 단량체와 MSN의 조성으로 조절되었다. 마지막으로 합성된 지능형 약물 전달체는 p-MSN2.5과 p-MSN5.0으로 명명 하였다. Mesoporous-silica-nanoparticle (MSN) 코어오 표면 코팅 된 p-NIBIm 층의 중요한 역할은 약물 전달 (또는 저장) 그리고 다공의 캡핑과 온도에 따른 ON/OFF 역할이다. 지능형 캡핑 재료인 공중합체의 swelling- 또는 shrinking- 감응은 10 oC에서 40 oC의 온도 범위에서 나타난다.
상기 재료의 약물 저장과 방출 패턴은 모델 약물인 cytochrome c를 사용하였다. 이러한 발전 된 약물 전달체는 흥미로운 약물 저장과 방출특성은; p-MSN2.5와 p-MSN5.0가 각각 10 oC에서 26.3%와 19.8% 그리고 40 oC에서 cytochrome C의 방출은 3 일과 4 일 동안 동안 >95%의 방출을 보였다. 재료의 세포 독성은 <0.125 mg/mL의 범위에서 약물 없이 진행 하였으며 human breast-cancer cells (MCF-7) 세포를 사용 하였다.
이 결과들은 본 재료가 특정 부위를 목표로 한 지능형 약물 전달체로써의 응용이 가능함을 보였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part I-A

A series of stimuli-responsive copolymers (p-NIBIm) of N-isopropylacrylamide (NIPAAm) and 1-butyl-3-vinyl imidazolium bromide (BVIm) with various BVIm monomer concentrations such as 5, 10, 15, and 20 mol% were synthesized by radical copolymerization. The different concentrations of the imidazolium moiety within the resulted copolymer chain were determined by 1H NMR analysis. The LCST (lower critical solution temperature) values of the copolymers that were checked by UV-Vis spectrophotometer increased with the increasing concentration
of the imidazolium moiety and were ranged from 36 up to 46 oC. According to the increasing concentration of the imidazolium moiety, the p-NIBIm copolymers also showed increasing zeta potential values (from +3.4 up to +21.3 mV) at pH 7, increasing initial and final micelle sizes (from 211.5 to 69.1 and from 325.4 to 171.2 nm), respectively, at 25 and 50 oC, and increasing contraction levels of micelle volumes between 25-50 oC (from 2.69×10-18 up to 8.67×10-18 cm3).
These results demonstrate that it is possible to tune the LCST value of a temperature-responsive copolymer only by changing the imidazolium unit (BVIm) concentration within the copolymer chain. Moreover, p-NIBIm10 and 15 among the prepared copolymers could demonstrate high applicability in various endeavors such as on a target drug or in a gene delivery system.

Part I-B

An ionic thermo-responsive copolymer with multiple lower critical solution temperatures (multi-LCSTs) has been developed, and the multi-LCSTs were easily changeable according to the various counter anion types. The multi-LCST values were achieved by introducing an ionic segment with an imidazolium moiety within the p-NIPAAm polymer chain to produce poly(NIPAAm-co-BVIm) copolymers, [p-NIBIm]+[Br]ꠑ, and changing the counter anion type to produce
[p-NIBIm]+[X]- (X = Cl, AcO, HCO3, BF4, CF3SO3, PF6, SbF6). The as-prepared temperature-responsive copolymers were physicochemically characterized via proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR), Fourier-transform infrared (FT-IR), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and thermogravimetric analysis (TGA). Their various LCST values, micelle sizes, and surface charges were determined using an Ultraviolet-visible spectrophotometer and a Zeta (ξ) sizer, which were fitted with temperature and stirring control. The copolymers showed a broad LCST spectrum between 39 oC and 52 oC. The Zeta (ξ) potential values at a pH = 7 decreased from about +9.7 for [p-NIBIm]+[X]- (X = Cl . Br) to about +2.0 mV for [p-NIBIm]+[X]- (X = PF6 . SbF6). The micelle size (or volume) of the copolymers with different anionic species gradually increased from 181.2 nm (or 2.49 × 10-17cm3) for [p-NIBIm]+[Br]- to 229.2 nm (or 5.04 × 10-17cm3) for [p-NIBIm]+[CF3SO3]-, showing a clear effect of the anion on themicelle size (or volume) at a constant temperature, such as body temperature. The fact that the most important physicochemical properties for the thermo-responsive copolymers, such as the LCST value, micelle size (or volume), and surface charge, could be easily controlled only through the anion exchange suggests these are highly applicable as ionic thermo-responsive copolymers in a drug (or gene, protein) delivery system.

Part II

In recent years there has been a significant increase in available strategies for developement of small intestine (and/or colon)-specific drug-delivery system to maximize the efficiency of therapeutic agents and to reduce side effects. However, only a few cases has fulfiled the needs to work in the complicate environments of the human intestinal tract. In this study, the preparation of a basic pH/temperature-responsive co-polymer and the characterizations of the in-vitro-drug delivery function in the pH range of 1-8 and in the temperature range of 25-42 oC were reported. The basic copolymer was prepared by radical copolymerization of N-isopropylacrylamide (NIPAAm) and N-vinylimidazole (VIm). The prepared copolymer (p-NIVIm) with 15 mol% concentration of the basic VIm unit and the surface charge of +9.1 mV at pH=7 was appeared to have the higher LCST (lower critical solution temperature) value such as 36.5-42oC in the stomach pH condition (~1.0) and the lower LCST value such as 35.8-38.2 oC in the small intestinal (and/or colon) pH condition (~8.0). The pH/temperature-dependent morphology- and micelle size- changes also were determined under dry and wet conditions, respectively, by SEM and ZetaSizer. The abilities to uptake a model protein (BSA) in body temperature and to release it in the conditions of 37 oC and pH 1-8 were determined. The drug loading capacity (LC) and efficiency (LE) of p-NIVIm at 37 oC/pH1 were 0.231 mg pro 1.0 mg copolymer and 92.4%, respectively. The drug carrier showed a slow release pattern in the low pH value of 1 (~0.084 mg; ~35 %) and then the sudden release pattern (~0.177 mg; ~73%) at the high pH of 8. The prepared copolymer with the pH-responsive protein-entrapping and -releasing behavior at body temperature will potentially be applied to be used as a novel small intestine (and/or colon) specific drug delivery system.

Part III

The preparation of the ideal smart drug-delivery systems were successfully achieved by the in situ co-polymerization of a vinyl group-functionalized mesoporous silica nanoparticle (f-MSN) with 1-butyl-3-vinyl imidazolium bromide (BVIm) and N-isopropyl acrylamide (NIPAAm) monomers. The thicknessof the capping copolymer layer, poly(NIPAAm-co-BVIm) (p-NIBIm), was controlled at between 2.5 nmand 5 nm, depending on the monomers/f-MSN ratio in the reaction solution. The finally obtained smart drug-delivery systems are named as p-MSN2.5 and p-MSN5.0 (MSNs integrated by 2.5 nm and 5 nm p-NIBIm layer in thickness). The key roles of the mesoporous-silica-nanoparticle (MSN) core and the p-NIBIm shell are drug-carrying (or containing) and pore-capping, respectively, and the latter has an on/off function that operates in accordance with temperature changes. According to the swelling- or shrinking-responses of the smart capping copolymer to temperature changes between 10 oC and 40 oC, the loading and releasing patterns of the model drug cytochrome c were studied in vitro. The developed system showed interesting performances such as a cytochrome C loading profile (loading capacity for3 h = 26.3% and 19.8% for p-MSN2.5 and p-MSN5.0, respectively) at 10oC and a cytochrome C releasing profile (releasing efficiency = > 95% within 3 days and 4 days for p-MSN2.5 and p-MSN5.0, respectively) at 40 oC. The cytotoxicity of the drug delivery systems, p-MSN2.5 and p-MSN5.0 (in the concentration range of <0.125 mg/mL without drug), for human breast-cancer cells (MCF-7) cells were minimal in vitro compared with that of a blank MSN. These results may be reasonably applied in the field of specified drug delivery.

목차 (Table of Contents)

• Part I-A
• Ⅰ. Introduction 1
• Ⅱ. Materials and Methods. 3
• 1. Materials. 3
• 2. Experimental Methods 3
• 2.1 Synthesis of 1-butyl-3-vinyl imidazolium bromide, [BVIm]Br, as an IL monomer 3
• 2.2 Synthesis of ionic Copolymers with different concentration of cationic unit, poly(NIPAAm-co-BVIm) or p-NIBIms 4
• 2.3 Synthesis of poly(1-butyl-3-vinylimidazolium bromide), and poly(N-isopropylacrylamide), p-NIPAAm, as reference polymers 4
• 2.4 Chemical characterization of the polymer. 5
• 2.5 Cytotoxicity assay. 6
• Ⅲ. Results and Discussion 8
• 1. Synthesis of the ionic thermo-sensitive copolymers with different concentrations of the ionic segment 8
• 2. LCST determination of the copolymers 9
• 3. Surface charge change of the series of the ionic copolymers, p-NIBIms 14
• 4. Temperature-dependant size change of the ionic copolymer micelles 16
• 5. Cytotoxicity assay 19
• Ⅳ. Conclusions. 21
• References 22
• Keywords 24
• 국문요약 25
• Part I-B
• Ⅰ. Introduction 32
• Ⅱ. Materials and Methods 35
• 1. Materials 35
• 2. Experimental Methods 35
• 2.1 Synthesis of the ionic copolymer 35
• 2.2 Anion exchange of the ionic copolymer to produce [p-NIBIm]+[X]- 36
• 2.3 Characterization of the ionic copolymers with various anions 36
• 2.4 Determination of the mean sizes and zeta potential values of the copolymers 37
• Ⅲ. Results and Discussion 38
• 1. Physicochemical characterization of [p-NIBIm]+[X]- 38
• 2. Anion dependence of the lower critical solution temperature values 44
• 3. Anion dependence of the polymer surface charge 50
• 4. Anion dependence of the micelle size 51
• Ⅳ. Conclusions 57
• References 58
• Keywords 62
• 국문요약 63
• Part II
• Ⅰ. Introduction 70
• Ⅱ. Experimental part 73
• 1. Materials 73
• 2. Synthesis and characterization of a basic copolymer, poly(NIPAAm-co-VIm) or p-NIVIm 73
• 3. Determination of the pH- and temperature-dependently loaded and released BSA protein amount for p-NIVIm 75
• Ⅲ. Results and Discussion 77
• 1. The temperature- and pH-responsive characteristics 77
• 2. Physicochemical characterization 80
• 3. pH- and temperature-dependent drug-loading and release profiles 85
• Ⅳ. Conclusions 91
• References 92
• Keywords 96
• 국문요약 97
• Part III
• Ⅰ. Introduction 106
• Ⅱ. Materials and Methods 108
• 1. Materials 108
• 2. Experimental Methods 108
• 2.1 Preparation of smart MSN drug-delivery systems 108
• 2.2 Physicochemical characterizations 109
• 2.3 Determination of the temperature-dependently loaded and released protein amounts 110
• 2.4 Cytotoxicity assay 111
• 2.5 Statics 112
• Ⅲ. Results and Discussion 113
• 1. Synthesis and characterization of thermo responsive copolymer coated meso porous silica nano-particles, p-MSN 113
• 2. Thermal behavior of the thermo responsive copolymer coated meso porous silica nano-particles, p-MSN 116
• 3. Cell viability 120
• Ⅳ. Conclusions 130
• References 132
• Keywords 134
• 국문요약 135