Synergistic Effects of Bee Venom and Natural Killer Cells on Inhibition of B16F10 Melanoma Cells through IL-4 mediated apoptosis

국문 초록 (Abstract)

연구목적: 본 연구는 봉독 (Bee Venom, BV)이 악성 흑색종 세포에서 NK-92 세포와 함께 IL-4로 매개되는 세포 자멸사를 촉진하여 암세포 성장 억제에 동반 상승효과를 나타냄을 밝히고자 하였다.

실험방법: 봉독이 NK-92 세포와 함께 악성 흑색종 세포의 성장을 억제하는 동반 상승효과가 있는지 확인하기 위해서 cell viability assay를 시행하였다. IL-4와 IL-4Rα, 세포 자멸사 조절 단백질 발현의 변동을 파악하기 위해 western blot analysis를 시행하였고, STAT6 (Signal transducer and activator of transcription6)의 활성을 알아보기 위해 EMSA (Electro mobility shift assay)를 병행하였다. 세포자멸사의 IL-4의 매개 여부를 알아보기 위해서 transfection assay 후 western blot analysis와 EMSA를 시행하여 IL-4와 IL-4Rα, 세포 자멸사 조절 단백질, STAT6의 활성의 변화를 파악하였다.

결 과
1. Cell viability assay 결과, 봉독은 NK-92MI 세포와 B16F10 melanoma 세포의 증식을 억제하는데 동반 상승효과를 나타내었다.

2. 봉독 및 NK-92MI 세포는 모두 IL-4 와 IL-4Rα, pro-apoptotic protein 인 caspae-9, cleaved caspae-9, caspae-3, cleaved caspae-3의 발현을 유의하게 증가시켰고, anti-apoptotic protein인 bcl-2의 발현은 유의하게 감소시켰다. 각각 처리한 군에 비하여 함께 처리한 군에서 발현의 증가와 감소는 더욱 현저하게 나타났다.

3. 봉독 및 NK-92MI 세포는 B16F10 melanoma 세포에서 STAT6의 활성을 증가시켰으며, 각각 처리한 군에 비하여 함께 처리한 군에서 활성이 현저하게 증가하였다.

4. Cell viability assay 결과, IL-4의 siRNA 처리 시 B16F10 melanoma 세포증식이 감소하였는데, 봉독과 NK-92MI 세포를 각각 처리한 군보다 동시에 처리한 군에서 감소가 현저하게 나타났다.

5. IL-4의 siRNA 처리 시, 봉독 및 NK-92MI 세포는 모두 IL-4 와 IL-4Rα, pro-apoptotic protein 인 caspae-9, cleaved caspae-9, caspae-3, cleaved caspae-3, Bax의 발현을 유의하게 감소시켰고, anti-apoptotic protein인 bcl-2의 발현은 유의하게 증가시켰다. 각각 처리한 군에 비하여 동시에 처리한 군에서 발현의 증가와 감소가 현저하게 나타났다.

6. IL-4의 siRNA 처리한 결과 B16F10 melanoma 세포에서 STAT6의 활성이 감소 되었고, 봉독과 NK-92MI 세포를 각각 처리한 군에 비하여 동시에 처리한 군에서 활성이 더욱 감소하였다.

결 론: 봉독이 NK-92MI 세포와 IL-4로 매개되는 세포 자멸사에 동반 상승효과를 나타내어 악성 흑색종의 성장을 억제하는 결과를 확인하였다. 이런 결과로 봉독이 NK-92 세포와 함께 악성 흑색종의 예방과 치료에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

I investigated whether synergistic cytotoxicty and apoptosis of BV and NK cells on B16F10 melanoma cells is medaited by IL-4. B16F10 melanoma cells co-punctured with NK-92MI cells and concomitantly treated by BV (5 ㎍/㎖) were inhibited proliferation of them, compared to BV (5 ㎍/㎖) or NK-92MI cells co-culture alone. Consistent with this result, expression of IL-4, IL-4Rαand that of pro-apoptotic protein such as caspases-3, cleaved caspase-3, caspase-9 and cleaved caspase-9 apoptotic was enhanced by co-culture of NK-92MI cells and treatment of BV (5 ㎍/㎖). Anti-apoptotic bcl-2 expression was decreased and activity of STAT6 and expression of STAT6 and p-STAT6 are enhanced in the same case as above. Additionally to confirm whether BV and NK cells inhibit the proliferation of malignant melanoma is mediated by IL-4, B16F10 melanoma cells were transfected with IL-4 siRNA (50 nM). Then, the experiment was carried out in the same way, so it came out against the above results.
Consequently, These results suggest that BV could be effectable alternative therapy for maligant melanoma through effect of cytotoxicity and apoptosis induced by BV and NK cells mediated by IL-4.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• Ⅰ. Introduction …………………………………………………………………… 1
• Ⅱ. Materials and Methods ……………………………………………………… 3
• 1. Materials …………………………………………………………………… 3
• 2. Cell culture ………………………………………………………………… 4
• 3. Cell viability assay …………………………………………………… 4
• 4. Western blot analysis …………………………………………………… 5
• 5. EMSA …………………………………………………………………………… 6
• 6. Transfection assay ……………………………………………………… 6
• 7. Date analysis ………………………………………………………… 6
• Ⅲ. Results ………………………………………………………………………… 7
• 1. Effects of BV and NK-92MI cells on cell viability in
• B16F10 melanoma cells ………………………………………………………… 7
• 2. Effect of BV and NK-92MI cells on the expression of
• apoptotic and cytotoxic regulatory proteins in B16F10 melanoma cells
• …………………………………………………………………………………… 9
• 3. Effects of BV on STAT6 activation in B16F10 melanoma cells
• …………………………………………………………………………………… 11
• 4. Reversed effects of IL-4 siRNA on BV and NK-92 cells-induced cell
• growth inhibition in B16F10 melanoma cells ………………………… 13
• 5. Reversed effects of IL-4 siRNA on BV and NK-92MI cells-induced
• apoptotic and cytotoxic regulatory protein expression in B16F10
• melanoma cells ………………………………………………………………… 15
• 6. Reversed effects of IL-4 siRNA on BV and NK-92MI cells-induced on
• STAT6 activation in B16F10 melanoma cells …………………………… 17
• Ⅳ. Discussion …………………………………………………………………… 19
• References …………………………………………………………………… 22