Functional Analysis of Chinese Cabbage Calreticulin 1 in Plant Regeneration

국문 초록 (Abstract)

칼레티큐린 (Calreticulin; CRT)은 소포체 (ER)에 존재하는 Ca^(2+) 결합 샤페론이다. 그러나 단순히 Ca^(2+) 저장 기능만을 수행하는 단백질이 아니라, Ca^(2+) 항상성, Ca^(2+) 신호전달에 대한 조절과 분자 샤페론 기능을 통하여 세포의 여러 가지 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 동물에서는 칼레티큐린이 단백질 접힘, 심장 발달, 배발생, 난세포 수정, 세포 점착과 스트레스 내성 등에 관여한다고 보고되어 있다. 식물에서도 칼레티큐린이 호르몬에 반응하고, 벼 현탁배양 세포의 재분화에 관여한다는 보고가 있으나, 아직까지 그 기능에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다.
본 연구에서는 칼레티큐린 유전자를 배추로부터 분리하여 BrCRT1 이라 명명하였으며, 그의 일반적인 분자생물학적인 특성과 세포 내 기능에 대해서 알아보았다. DNA 염기서열을 분석해 본 결과 BrCRT1은 1,516개의 염기쌍을 가지고 있었으며, 분자량이 60 kDa, 등전점이 4.6인 422개의 아미노산을 암호화하는 것으로 추정되었다. BrCRT1의 아미노산 서열을 다른 식물체의 칼레티큐린과 비교해 본 결과, 상당히 높은 유사성 (70-93%)을 나타내었으며, 특히 애기장대 칼레티큐린 (AtCRT1)과는 93%의 높은 유사성을 보여주었다. Genomic southern blot 실험을 수행한 결과, BrCRT1은 게놈상에서 적어도 두 개 이상의 유전자로 존재 할 것으로 추측되어 졌다. BrCRT1 mRNA는 생장이 왕성하게 일어나는 뿌리, 어린 잎과 꽃에서 많이 발현되었고, 성숙된 잎이나 종자에서는 거의 발현되지 않았다.
식물 세포 내에서의 BrCRT1의 기능을 알아보기 위하여 CaMV 35S promoter를 이용하여 BrCRT1 과발현과 발현억제 담배 형질전환식물을 만들었다. BrCRT1 유전자를 가지고 있는 Agrobacterium을 담배 잎 절편체에 접종하여 신초 유도 배지에서 신초 재분화를 유도했을 때, BrCRT1의 과발현과 발현억제에 의해 신초 재분화의 효율이 상당한 차이를 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 실제로 형질전환식물을 가지고 재분화 실험을 해 본 결과, BrCRT1의 과발현에 의해 신초와 뿌리의 재분화 효율이 현저하게 증가하였고, 반대로 BrCRT1의 발현억제에 의해서는 신초와 뿌리 재분화 효율이 감소하였다. 신초와 뿌리 재분화에서 결정적인 작용을 하는 옥신과 싸이토키닌을 배추 잎에 처리하여 northern blot 분석을 수행한 결과, BrCRT1 mRNA는 호르몬 처리 30 분대에서부터 유도되기 시작하여 1 시간 후에 최고치에 도달하는 것을 볼 수 있었다. 또한, 호르몬에 의한 BrCRT1 mRNA의 유도가 단백질 생합성 억제제인 CHX의 처리에 의해 크게 억제되었다. 이들의 결과를 종합하여 볼 때, BrCRT1은 절편체가 외부의 호르몬 신호를 인지하는 능력을 가지는 재분화 초기 단계에서부터 작용할 것으로 추정되며, 호르몬에 빨리 반응하는 초기 반응 유전자이나, 1차적인 반응 유전자는 아닌 것으로 추정된다.
칼레티큐린과 세포 주기와의 연관성을 알아보기 위하여 세포 주기에 관련된 유전자들이 비교적 규명이 잘 되어있는 애기장대를 사용하여 실험을 수행하였다. BrCRT1 과발현 애기장대 형질전환식물은 담배와 마찬가지로 CaMV 35S promoter를 이용하여 만들었고, 애기장대 칼레티큐린 녹아웃 돌연변이체 (crt1)는 SIGnAL社에서 종자를 구입하여 PCR 분석을 통하여 동형 접합체 돌연변이체를 선발하였다. 이들 형질전환 애기장대와 돌연변이체를 이용하여 재분화 실험을 수행해 본 결과, 담배 형질전환식물을 이용한 실험과 비슷한 결과를 얻을 수 있었다. 즉, BrCRT1의 과발현에 의해 신초와 뿌리의 재분화 효율이 현저하게 증가하였고, 반대로 AtCRT1의 녹아웃에 의해서는 신초와 뿌리 재분화 효율이 감소하였다. 또한, 신초 재분화에서는 BrCRT1의 과발현에 의한 신초 재분화 효율의 증가보다 AtCRT1의 녹아웃에 의한 신초 재분화 효율의 감소가 더 컸고, 뿌리 재분화에서는 반대로 BrCRT1의 과발현에 의한 뿌리 재분화 효율의 증가가 AtCRT1의 녹아웃에 의한 뿌리 재분화 효율의 감소보다 훨씬 더 컸다. 따라서 애기장대 신초 재분화에서는 AtCRT1의 녹아웃에 의한 신초 재분화 효율의 감소가 다른 유전자들에 의해 쉽게 미봉이 되지 않지만, 뿌리 재분화에서는 AtCRT1의 녹아웃에 의한 뿌리 재분화 효율의 감소가 다른 유전자들에 의해 쉽게 미봉이 되는 것으로 추정된다. 애기장대 형질전환체와 돌연변이체에서 호르몬에 의해 조절되거나 세포 주기와 관련된 유전자들인 CycD3과 CDK의 발현 양상을 RT-PCR을 통하여 분석해 본 결과, 이들 유전자들의 발현이 BrCRT1의 과발현에 의해서는 증가하였고, 반대로 AtCRT1의 녹아웃에 의해서는 감소되었다.
이상의 결과를 종합해 볼 때, 칼레티큐린은 옥신 또는 싸이토키닌 신호전달체계의 상류쪽에서 작용하여 하류쪽에 있는 세포 주기 관련 유전자들인 CycD3 이나 CDK에 영향을 미침으로서 세포분열 주기에 관여하고, 따라서 식물체의 신초와 뿌리 재분화에 관여할 것으로 추정된다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• CONTENTS = Ⅰ
• LIST OF FIGURES = Ⅱ
• LIST OF TABLE = Ⅲ
• ABBREVIATIONS = Ⅵ
• 초록(SUMMARY IN KOREAN) = Ⅶ
• Ⅰ. INTRODUCTION = 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 7
• Ⅲ. RESULTS = 14
• 1. Molecular cloning and characterization of BrCRT1 = 14
• 1-1. Molecular cloning and sequence analysis of BrCRT1 = 14
• 1-2. Genomic organization and expression of BrCRT1 = 19
• 2. Functional analysis of BrCRT1 by transgenic tobacco plants = 22
• 2-1. Establishment of transgenic tobacco plants = 22
• 2-2. Altered expression of BrCRT1 at the mRNA and protein levels in transgenic tobacco plants = 26
• 2-3. Overexpression of BrCRT1 retards plant growth = 26
• 2-4. The efficiency of shoot and root regeneration in control and transgenic plants = 29
• 2-5. Expression of BrCRT1 by growth regulators = 32
• 2-6. Expression of BrCRT1 during shoot and root regeneration = 33
• 3. Functional analysis of BrCRT1 in Arabidopsis = 37
• 3-1. Establishment of transgenic and mutant Arabidopsis plants = 37
• 3-2. The efficiency of shoot and root regeneration in TG and crt1 = 41
• 3-3. Responses of the TG and crt1 to cytokinin and auxin = 41
• 3-4. Expression of the cell cycle-regulated genes in TG and crt1 = 43
• Ⅳ. DISCUSSION = 49
• Ⅴ. CONCLUSIONS = 54
• Ⅵ. REFERENCES = 56
• 감사의 글 = 69