관상동맥질환의 위험인자인 호모시스테인에 특이적인 단일사슬항체 발굴 및 특성 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Homocysteine is an amino acid containing a free thiol moiety. The level of homocysteine in plasma relates to cardiovascular and Alzheimer’s disease, and the measurement of homocysteine is important for diagnosis of such disease. However, selective and efficient detection of Homocysteine (Hcy) is difficult due to the interference of structurely similar compounds such as Cysteine (Cys) and Glutathione (Glu). To develop a selective detection method, we synthesized an adduct of homocysteine and a coumarin-derivative, and screened M13 bacteriophage library displaying single chain variable fragment (scFv). After 4 rounds of biopanning, a scFv clone which is specific to homocysteine coumarin-derivative was identified. The purified scFv showed specific binding on homocysteine coumarin–derivative, not cysteine coumarin-derivative. This scFv will be used for an efficient and selective detection of homocysteine in plasma.

Keyword : homocysteine, cysteine, hyperhomocysteinemia, M13 phage display library, single chain antibody, complementarity determining region, biopanning

국문 초록 (Abstract)

심혈관계 질환의 독립적인 위험인자로 알려진 호모시스테인은 시스테인과 메티오닌의 대사과정에서 생성되는 아미노산으로, 오랫동안 그 농도 측정을 위해 많은 연구가 선행되어왔다. 하지만 혈장에는 그와 구조가 비슷한 시스테인, 글루타치온 등이 존재하여 분리가 어렵고 그로 인해 농도 측정이 간단하지 않고 오랜 시간이 걸린다는 단점이 있다.
본 연구에서는 그러한 문제들을 해결하고자 기존의 연구에서 밝혀진, 여러 아미노산 중에서 호모시스테인, 시스테인과만 반응하는 형광물질과 유사한 물질을 합성하고, 그 두 아미노산과 각각 결합시켰다. 이러한 유도체는 항원-항체반응 원리를 이용한 바이오패닝을 통해, 수많은 종류의 단일사슬항체를 표지하고 있는 M13 단일사슬항체 파지 라이브러리에서 유도체에 특이적으로 결합하는 단일사슬항체를 발굴하였다. 그리고 말토오스 결합 단백질을 연결시켜 대장균에서의 발현도를 향상시키고 정제를 용이하도록 하였다. 정제된 단일사슬항체는 앞서 합성한 유도체들과의 결합력을 형광 분석기로 분석함으로써 호모시스테인 유도체와 단일사슬항체와의 특이적인 결합을 보았다. 이렇게 발굴된 단일사슬항체는 호모시스테인과 특이적으로 결합하기에 호모시스테인의 농도측정을 용이하게 하도록 할 것이다. 추가적으로 단일사슬항체와 호모시스테인의 결합 특이성인 해리상수의 측정을 통해 센서나 기타 심혈관 질병진단 등에 사용할 수 있는 지의 검토가 필요할 것이다.

주제어 : 호모시스테인, 시스테인, 고호모시스테인혈증, M13 파지 디스플레이 라이브러리, 단일사슬항체, 상보성 결정부위, 바이오패닝

목차 (Table of Contents)

• Contents
• List of Figures … Ⅲ
• List of Abbreviation … Ⅴ
• Abstract … Ⅶ
• 1. Introduction
• 1-1 What is the Homocysteine … 1
• 1-2 Phage display single chain variable fragment (scFv) library screening … 5
• 1-3 Purpose of this study … 9
• 2. Materials & methods
• 2-1 Materials … 11
• 2-2 Synthesis of Homocysteine (Hcy) and Cysteine (Cys) coumarin-derivative … 12
• 2-3 Immobilization of the synthesized derivatives on Bovine serum albumin (BSA) … 14
• 2-4 Biopanning against immobilized Hcy derivative … 15
• 2-5 Selectivity test of Hcy derivative specific scFv … 18
• 2-6 Expression and purification of scFv … 21
• 2-7 scFv affinity test using Size exclusion chromatography (SEC) … 23
• 3. Results
• 3-1 Identification of Hcy derivative specific scFvs by biopanning and ELISA … 24
• 3-2 Expression and purification of scFv … 28
• 3-3 Characterization of binding characteristic of scFv to Hcy derivative … 30
• 4. Discussion … 32
• 5. Reference … 33
• 6. 국문초록 … 35
• 7. 감사의 글 … 37