Prevalence, risk factors, and therapeutic efficacy of crisdesalazine and flusalazine for canine cognitive dysfunction syndrome in South Korea = 한국에서의 개 인지기능장애 증후군에 대한 유병률, 위험인자 및 크리스데살라진과 플루살라진의 치료 효과

국문 초록 (Abstract)

개의 치매라고도 알려진 인지기능장애 증후군 (canine cognitive dysfunction syndrome; CCDS)은 나이가 들면서 진행되는 인지 기능의 손상과 관련된 신경 퇴행성 장애에 해당한다 (Schneider and Erhard, 2010). 이 질환에 걸린 반려견은 지각, 기억, 판단력과 같은 인지 능력에 어려움을 겪게 되고, 뇌세포의 점진적인 손상으로 인해 조기 사망으로 이어질 수도 있다. 현재 미국의 경우 3천만 마리, 유럽의 경우 1,500만 마리 이상의 반려견이 인지기능장애 증후군을 앓고 있으며, 반려견의 유병률은 11~12세 사이에서 28%, 15~16세 사이에서 68%로 매우 높다 (Osella, M. C, 2007). 그러나 전 세계 어느 나라보다도 노령 반려견의 비율이 높은 대한민국의 경우, 인지기능장애 증후군 (CCDS)의 유병률과 위험 인자 등에 대한 기초 연구가 전무한 상황이다. 또한, 단순히 초기 증상만 개선하는 것이 아니라 질병의 진행을 늦추거나, 병태생리학적 원인을 치료할 수 있는 보다 효과적이고 안전한 질병 조절 약물로서의 동물용 의약품 개발이 필요하다는 사실에 근거하여 본 연구를 진행하게 되었다. 이 논문은 세 부분으로 구성되어 있다. 논문의 첫 번째 파트에서는 한국의 특히 중소형견에서 인지기능장애 증후군의 유병률 및 연령, 성별, 중성화 여부, 체구, 품종 (순종 또는 혼합 포함)과 인지기능장애 증후군의 연관성에 대해 조사하기 위해 2021년 5월부터 2022년 12월까지 총 1,828마리 (5~21세; 수컷 958마리, 암컷 870마리)의 반려견 보호자들을 대상으로 대규모의 횡단면 역학 연구를 진행하였다. 이 전의 연구들을 참고하여 연구 대상 반려견들을 개 인지기능장애 평가척도 (CCDR)를 기준으로 정상 (40점 미만), 위험 (40-49점), 인지기능장애 (50점 이상)의 세 그룹으로 분류하였다 (Salvin et al., 2011). 또한, 대상견들의 나이에 따라 5-8세, 9-11세, 12-14세, 15-17세, 18세 이상의 다섯 그룹으로 다시 나누어 연령대별 유병률을 조사하였다. 전체 조사대상 개들에서 인지기능장애 증후군의 유병률은 20.3% (371/1828 마리)였다. 중소형견의 경우, 인지기능장애 증후군의 유병률은 연령에 따라 유의적인 차이를 보였으며 (카이제곱 검정; p<0.0001, df=8), 연령이 높아질수록 증가하였다 (5~8세; 2.91% [13/446], 9-11세; 10.14% [37/365], 12-14세; 18.86% [96/509], 15-17세; 39.00% [156/400], ≥18세; 63.89% [69/108]). 또한, 연령과 개 인지기능장애 평가척도 (CCDR) 점수 사이에는 양의 상관관계가 있었다 (피어슨 상관관계 계수; r=0.49, 95% 신뢰구간[CI]: 0.46-0.53, p<0.0001). 그러나 성별과 중성화 여부 또는 혼합품종견과 순종견 사이의 유병률에서는 유의적인 차이가 확인되지 않았다. 또한, 일부 품종에서 인지기능장애 증후군의 발병률이 상대적으로 높은 것으로 확인되었지만, 각 품종 그룹 간의 수와 연령의 분포가 균등하지 않았기 때문에 특정 품종에서의 유병률이 더 높다고 결론짓기는 어려웠으며, 이에 대해서는 향후 추가 연구가 필요하다. 본 연구에서 다변량 로지스틱 회귀 분석을 진행한 결과에 의하면, 연령이 개 인지기능장애 증후군의 유의미한 예측 변수 (OR=1.37, 95% CI: 1.31-1.43, p<0.0001)였으며, 체구, 성별, 중성화 여부와 같은 다른 독립 변수는 한국에서의 개 인지기능장애 증후군의 예측 변수로 고려할 수 없었다. 두 번째 파트에서는 실험쥐를 대상으로 2-아세톡시-5-(2-4(트리플루오로메틸)-페닐아미노)-벤조산 (플루살라진)의 항염증 효과와 안전성을 평가하였다. 플루살라진은 최근 반려견 인지기능장애 증후군의 신약 치료제로 주목 받고 있는 크리스데살라진의 전구약물이다. 본 연구를 수행한 이유는 최근 사람의 치매에서 염증과 산화적 손상이 중요한 병태생리학적 원인 가설로 주목 받고 있기 때문이다. 이전 연구에 따르면, 플루살라진은 활성산소와 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 매개 염증을 모두 표적으로 하여 급성 췌장염의 중증도를 감소시키며, COX-1 또는 COX-2 억제가 아닌 마이크로솜 프로스타글란딘 E 신타제-1 (mPEGS-1)에 특이적인 억제를 통해 항염증 작용을 한다는 것이 확인되었다 (Lee, 2012). 이러한 사실에 근거하여 플루살라진과 대조 약물인 아스피린, 인도메타신을 체중 20~25g의 수컷 ICR 마우스에 투여하여 진통, 항염증 효과와 부작용을 평가하였다. 평가 결과 플루살라진은 내장성, 신경성 및 염증성 통증 반응 등을 효과적으로 완화하며 강력한 항염증 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 심각한 위 손상을 유발할 수 있는 아스피린과 인도메타신 등과 같은 전통적인 NSAIDs와 달리, 플루살라진은 대조약물들보다 고용량인 최대 1000 mg/kg까지 투여한 경우에도 위 손상이 없어 보다 더 안전한 특징을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 마지막 세 번째 파트에서는 플루살라진의 주요 대사체인 크리스데살라진 (AAD-2004)을 4주 및 8주에 걸쳐 인지기능장애 증후군에 이환된 환견들에게 투여하여 임상적 효능을 평가하였다. 이 연구는 크리스데살라진이 아직 개 인지기능장애 증후군에 대한 신약 후보였을 때 수행되었기 때문에 크리스데살라진을 “AAD-2004”라고 명명하고 진행하였다. 이전 연구들에서 AAD-2004 (크리스데살라진)는 실험실 내 및 생체 내에서 다양한 항염증 및 항산화 효과를 가진 신약 후보물질임이 확인되었다 (Lee, 2012; Nilsson et al., 2003; Ryu et al., 2003; Thomas et al., 2001; Tortosa et al., 2006). 이는 항염증 작용을 하는 살리실산염과 항산화 작용을 하는 설파살라진 두 가지 성분의 합제로서, mPGES-1을 선택적으로 차단하고 N-메틸-D-아스파트산염 (N-methyl-D-aspartate; NMDA) 신경독성을 억제하는 동시에 산화 스트레스를 약화시켜 다른 NSAIDs 들보다 유리한 이점을 가지고 있다 (Ryu et al., 2003). 이뿐만 아니라 다른 전통적인 NSAIDs 들과 달리 부작용 없이 다양한 염증 매개물질들을 차단하여 강력한 항염증 효과를 나타낸다. 신경세포 손실의 주요 병리학적 기전인 산화적 스트레스와 염증을 억제하는 이러한 특징들로 인해 AAD-2004는 알츠하이머병과 개 인지기능장애 증후군 (CCDS)을 포함한 신경 퇴행성 질환들을 치료할 수 있는 유망한 후보 물질로 의학 및 수의학 모두에서 주목을 받고 있다. 또한, 개 인지기능장애 증후군은 병태생리학적 기전 및 임상 증상 측면 등에서 사람의 치매와 유사한 점이 매우 많다는 점에 착안하여 본 연구에서는 최종적으로 AAD-2004를 개 인지기능장애 증후군의 치료약물 후보로 선정하였다. 본 임상시험의 일차적인 목표는 인지기능장애 증후군 환견들에게 AAD-2004를 경구 투여 시 인지기능저하를 개선시킬 수 있는지 알아보는 것이었으며, 이차 목표는 해당 기간 동안의 안전성을 평가하는 것이었다. 시험의 유효성을 높이기 위해 맹검, 무작위 연구로 진행하였으며, 투여 용량은 소형 반려견을 대상으로 진행한 이 전의 파일럿 연구와 AAD-2004의 비임상 효능 데이터를 토대로 결정하였으며, 안전 구간은 독성 시험과 앞서 비글견들을 대상으로 한 8주 간의 경구 투여 시험에서 얻은 약동학적 데이터를 기반으로 하였다. 연구의 편향성을 최소화하기 위해 모든 포함 기준을 충족하고 제외 기준이 없는 개들을 대상으로 두 그룹 (위약 n=5, AAD-2004 5 mg/kg n=5)으로 나누어 무작위 배정 방식으로 진행하였다. 투여 4주차와 투여 8주차에 위약군의 개 인지기능장애 평가척도 (CCDR) 평균 점수와 표준 편차는 58.4 ± 4.037과 63.6 ± 9.839로 투여 전보다 증가하였다. 이와 대조적으로 투여 4주차와 투여 8주차에 치료군의 평균 점수와 표준 편차는 41.2 ± 11.61점, 39.4 ± 13.01점으로 투여 전 (0주차)에 비해 현저히 감소하였다 (치료군의 RM 일원 분산분석: 0주차 vs 4주차 vs 8주차, p<0.05). 4주차에 치료군의 개 인지기능장애 평가척도 (CCDR) 평균 점수는 45점 이하로, 8주차에는 40점 이하로 감소하여 인지기능장애가 임상적으로 뚜렷하게 개선되는 것으로 나타났으며, 이후 치료군들은 정상적인 노령견 수준의 인지기능을 보이는 것이 확인되었다. 이러한 결과는 개 치매 척도 (CADES) 상에서도 유사하게 확인되었다. 투여 4주차와 투여 8주차에 위약군의 개 치매 척도 (CADES) 평균 점수와 표준 편차는 71.8 ± 15.88점, 75 ± 15.46점으로 투여 전보다 증가하였으나, 투여 4주차 및 투여 8주차에 치료군의 평균 점수와 표준 편차는 56.6 ± 24.14 및 43.4 ± 26.33으로 투여 전 (0주차)에 비해 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (치료군의 RM 일원 분산분석: 0주차 vs 4주차 vs 8주차, p<0.05). 마찬가지로 4주차에 치료군의 평균 개 치매 척도 (CADES) 점수는 60점 이하로 감소하고 8주차에 45점 이하로 감소하면서 인지기능장애가 뚜렷하게 개선되는 것으로 나타났다. 따라서 AAD-2004는 5 mg/kg의 용량에서 개 인지기능장애 증후군 치료에 임상적인 효능을 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 임상시험 전 기간에 걸쳐 위약 그룹에 비해 치료 그룹에서 임상적으로 유의미한 부작용은 관찰되지 않았다. 결론적으로, 한국에서 중소형 견의 인지기능장애 증후군 유병률은 연령에 따라 크게 차이가 있었으며, 연령이 증가함에 따라 그 유병률도 증가하였다. 하지만 성별, 중성화 여부, 체구 및 품종 등에서는 유의미한 차이가 확인되지 않았다. 플루살라진은 실험용 쥐에서 효과적이고 안전한 항염증 작용을 나타내는 것이 확인되었으며, 크리스데살라진 (AAD-2004)은 개의 인지기능장애 증후군에 대해 임상적인 효과가 있음이 확인되었다. 이러한 결과들은 크리스데살라진이 개 인지기능장애 증후군 치료를 위한 효과적이고 안전한 동물용 의약품으로서의 잠재력이 있음을 시사하며, 본 약물의 효능과 안전성에 대한 추가적인 대규모 장기 연구가 필요하다. 주요어: 개 인지기능장애 증후군 / 크리스데살라진 / 플루살라진 / 알츠하이머 병 학번: 2013-30495

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Canine cognitive dysfunction syndrome (CCDS), characterized by dementia in dogs, is a type of degenerative nervous system disorder associated with the progressive impairment of cognitive function with advanced age (Schneider & Erhard, 2010). Dogs with CCDS experience difficulties related to cognitive abilities such as awareness, memory, and decision-making, and the progressive damage to brain cells can even result in premature death. Currently, more than 30 million pet dogs in the U.S. and over 15 million in Europe are affected by CCDS. The prevalence of dementia in pet dogs is 28% between 11 and 12 years and much higher, at 68%, between 15 and 16 years of age (Osella, M. C., 2007). However, there has been no basic research on the prevalence and risk factors of CCDS in older dogs in South Korea, which has the highest proportion of aged pet dogs of any country in the world. Furthermore, there is a need for developing an effective and safe disease-modifying veterinary drug to not only improve early symptoms but also to slow disease progression and treat the pathophysiological causes of the disease. These factors motivated the present studies. This dissertation is composed of three parts. The first part was a large cross-sectional epidemiological study to assess the prevalence of CCDS among small-to-medium sized dogs and the associations between CCDS prevalence and age, sex, neuter status, body size, and breed (including pure or mixed) in South Korea. The owners of 1,828 dogs (age 5–21 years; 958 males, 870 females) participated in a survey between May 2021 and December 2022. The dogs were classified into three groups based on the canine cognitive dysfunction rating (CCDR) score: normal (score <40), at risk (score, 40–49), and CCDS (score ≥50) as previously described (Salvin et al., 2011). The dogs were also divided into five groups according to their age (5–8, 9–11, 12–14, 15–17, and ≥18 years). The overall prevalence of CCDS was 20.3% (371/1828). Among small-to-medium sized dogs, CCDS prevalence differed significantly (chi-square test; p<0.0001, df=8) and increased with age (5–8 years: 2.91% [13/446], 9–11 years: 10.14% [37/365], 12–14 years: 18.86% [96/509], 15–17 years: 39.00% [156/400], ≥18 years: 63.89% [69/108]). Moreover, there was a positive correlation between age and CCDR score, which is indicative of cognitive impairment (Pearson correlation coefficient r=0.49, 95% confidence interval [CI]: 0.46–0.53, p<0.0001). However, there was no significant difference in CCDS incidence by sex and spay/neuter status or between mixed-breed and purebred dogs. Furthermore, although a higher incidence of CCDS has been identified in some breeds, the sample size and age distributions for different breeds in this study were not consistent, and therefore further research will be needed in this context. Multivariable logistic regression analysis showed that age was a significant predictor variable (OR=1.37, 95% CI: 1.31–1.43, p<0.0001) for CCDS. Other independent variables such as body size, sex and neuter status were not identified as predictor variables for CCDS in South Korea. The second part of this dissertation was designed to evaluate the anti-inflammatory activity and safety of 2–acetoxy–5-(2-4 (trifluoromethyl)- phenethylamino)-benzoic acid (flusalazine) in mice. Flusalazine, a prodrug of crisdesalazine, has emerged as a promising treatment for CCDS. This study was motivated by the recognition of inflammation and oxidative damage as key pathophysiologic mechanisms in human dementia. Flusalazine has been shown to reduce acute pancreatitis severity by targeting free radicals and prostaglandin E2 (PGE2)-mediated inflammation through microsomal prostaglandin E synthase-1 (mPGES-1); - specific inhibition, rather than COX-1 or COX-2 inhibition (Lee, 2012). Male Institute of Cancer Research (ICR) mice (20-25g) were administered flusalazine, aspirin, or indomethacin to assess analgesic and anti- inflammatory effects and side effects. Flusalazine effectively attenuated visceral, neurogenic, and inflammatory pain responses and demonstrated potent anti-inflammatory effects. Unlike traditional NSAIDs such as aspirin and indomethacin, which cause severe gastric damage, flusalazine showed no gastric damage at doses up to 1000 mg/kg, indicating a superior safety profile. The final part of the dissertation examined the clinical efficacy of crisdesalazine (referred to as AAD-2004) in dogs with CCDS over 4 and 8 weeks. Because this part of the study was conducted while crisdesalazine was still a drug candidate for canine CCDS, crisdesalazine has been referred to as “AAD-2004”. AAD-2004 (crisdesalazine) had been identified as a new drug candidate with various anti-inflammatory and anti-oxidant effects in vitro and in vivo (Lee, 2012; Nilsson et al., 2003; Ryu et al., 2003; Thomas et al., 2001; Tortosa et al., 2006). It combines salicylates (anti- inflammatory) and sulfasalazine (anti-oxidant), offering advantages over other NSAIDs by selectively blocking mPGES-1 and inhibiting N-methyl- D-aspartate (NMDA) neurotoxicity while attenuating oxidative stress (Ryu et al., 2003). Furthermore, AAD-2004 inhibiting various inflammatory mediators without the side effects associated with traditional NSAIDs. These properties make AAD-2004 a promising candidate for treating neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and canine cognitive dysfunction syndrome (CCDS). Its potential to inhibit oxidative stress and inflammation—key pathological mechanisms in neuronal loss— has garnered attention in both human and veterinary medicine. Given the similarities between CCDS and human dementia in terms of pathophysiology and clinical manifestations, we selected AAD-2004 for clinical testing in dogs with CCDS. Our primary objective was to assess whether oral administration of AAD-2004 could improve cognitive dysfunction in affected dogs. Additionally, we aimed to evaluate its safety profile during the treatment period. A blinded, randomized study design was implemented to enhance the trial's validity. Dose levels were determined based on AAD-2004's non- clinical efficacy data, including a pilot study on pet dogs. The safety window was estimated using toxicity studies and pharmacokinetic data from a previous 8-week oral administration study in beagles. To minimize bias, dogs meeting all inclusion and no exclusion criteria were randomly assigned to either the placebo (n=5) or AAD-2004 5 mg/kg (n=5) group, ensuring comparability between groups. The mean CCDR scores (± standard deviation) in the placebo group increased from baseline at weeks 4 and 8 (58.4 ± 4.037 and 63.6 ± 9.839, respectively). In contrast, the treatment group showed a significant decrease (41.2 ± 11.61 and 39.4 ± 13.01 at weeks 4 and 8, respectively; repeated measures one-way ANOVA: p<0.05). CCDS improvement was evident as the treatment group's mean CCDR scores decreased to ≤45 at week 4 and ≤ 40 at week 8, indicating a return to normal cognitive function for older dogs. Similar trends were observed using the CADES score. The placebo group's scores increased (71.8 ± 15.88 at week 4, 75 ± 15.46 at week 8), while the treatment group's scores decreased significantly (56.6 ± 24.14 at week 4, 43.4 ± 26.33 at week 8; RM one-way ANOVA: p<0.05). Likewise, CCDS improvement was evident as the treatment group's mean CADES scores decreased to ≤60 at week 4 and ≤45 at week 8. AAD-2004 demonstrated clinical efficacy for CCDS treatment at 5 mg/kg, with no clinically significant adverse events observed compared to the placebo group. In conclusion, this research demonstrated that CCDS prevalence in small-to-medium sized dogs increased with age but was not significantly affected by sex, neuter status, body size, and breed in South Korea. Flusalazine showed effective and safe anti-inflammatory activity in mice, while crisdesalazine (AAD-2004) emerged as a promising treatment for CCDS in dogs. These findings suggest crisdesalazine's potential as an effective and safe veterinary drug for CCDS treatment, warranting further large-scale, long-term studies. Keywords: Canine cognitive dysfunction syndrome / Crisdesalazine / Flusalazine / Alzheimer’s disease Student Number: 2013-30495

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT ⅰ
• CONTENTS viii
• LIST OF TABLES xiii
• LIST OF FIGURES xiv
• ABBREVIATIONS xv
• LITERATURE REVIEW
• 1. Generalities of cognitive dysfunction syndrome 1
• 2. Generalities of oxidative stress in CCDS and AD 3
• 3. Generalities of inflammation in CCDS and AD 5
• 4. Generalities of neuropathologic changes in CCDS and AD 6
• Chapter I. Prevalence and risk factors of canine cognitive
• dysfunction syndrome in South Korea
• 1. Introduction 9
• 2. Materials and methods 12
• 2.1. Selection of dogs 12
• 2.2. Questionnaire and assessment 12
• 2.3. CCDS diagnosis and grouping 13
• 2.4. Statistical analysis 13
• 3. Results 14
• 3.1. Prevalence of CCDS based on age 14
• 3.2. Prevalence of CCDS based on sex 14
• 3.3. Prevalence of CCDS based on age after body weight-matching
• 15
• 3.4. Prevalence of CCDS based on breed 15
• 3.5. Prevalence of CCDS based on breed after age-matching 16
• 3.6. Multivariable logistic regression analysis for possible risk
• factors 16
• 4. Discussion 17
• 5. Tables and figures 21
• Chapter Ⅱ. Potent analgesic action of 2-acetoxy-5-(2-4
• (trifluoromethyl)-phenethylamino)-benzoic acid
• (flusalazine) in experimental mice
• 1. Introduction 30
• 2. Materials and methods 32
• 2.1. Experimental animals 32
• 2.2. Acetic acid-induced abdominal writhing 33
• 2.3. Formalin test 33
• 2.4. Tail immersion test 34
• 2.5. Carrageenan-induced hind paw edema and hyperalgesia 34
• 2.6. Gastrointestinal safety assessment 35
• 2.7. PGES activity assay 36
• 2.8. Prostaglandin production in the peritoneal cavity 37
• 2.9. Statistical analysis 37
• 3. Results..37
• 3.1. Flusalazine rescued acetic acid-induced abdominal pain 37
• 3.2. Flusalazine reduces formalin-induced neurogenic and
• inflammatory pain 38
• 3.3. Flusalazine prevents acute thermal nociceptive pain 38
• 3.4. Flusalazine reduced carrageenan-induced inflammatory pain 39
• 3.5. Flusalazine does not cause gastric damage 39
• 3.6. Prostaglandin production in the peritoneal cavity 40
• 3.7. Therapeutic index between the effective dose and toxic dose 40
• 4. Discussion 40
• 5. Tables and figures 47
• Chapter Ⅲ. Clinical trial to assess the efficacy and safety of
• crisdesalazine for canine cognitive dysfunction syndrome
• treatment
• 1. Introduction 54
• 2. Materials and methods 57
• 2.1. Study objectives 57
• 2.2. Study design 57
• 2.3. Subject enrollment 58
• 2.4. Inclusion criteria 58
• 2.5. Exclusion criteria 59
• 2.6. Concomitant therapy 59
• 2.7. Observations per visit time 59
• 2.8. Randomization 59
• 2.9. Blinding and unblinding 60
• 2.10. Administration and treatment 61
• 2.11. Multivariate analysis 61
• 3. Results 62
• 3.1. Number of canine participants 62
• 3.2. Analysis of total CCDR scores prior to (at week 0) and at weeks
• 4 and 8 after administration 62
• 3.3. Analysis of total CADES scores prior to (at week 0) and at
• weeks 4 and 8 after administration 63
• 3.4. Safety analysis 64
• 4. Discussion 64
• 5. Tables and figures . 67
• GENERAL CONCLUSION 78
• REFERENCES 80
• 국 문 초 록 104