Analysis of Coupling Between Poly(A) Tail Length and Translation Activity Using Long-read Sequencing = 긴 길이 염기서열분석을 이용한 폴리A 꼬리과 번역 효율의 상관관계 분석

국문 초록 (Abstract)

다양한 생물학적 맥락에서 대부분의 표현형의 결정은 궁극적으로 단백질의 발현량에 의해 결정된다. 하지만 단백질의 정량화는 접근성과 해석의 어려움에 의해 양적 연구에 쉽게 고려되지 않고, 보다 간단한 정보로 이루어진 리보핵산(RNA)의 정량화를 통해 이루어진다. 하지만 RNA의 생산 및 분해 조절에 의지하는 양적생물학연구는 RNA에 의한 번역 효율을 고려하지 못한다는 점에서 그 문제가 있다. 이러한 RNA에 의한 번역 효율을 연구하기 위한 실험방법에는 폴리리보솜 구획법이 있다. 이는 사이클로헥시미드(CHX)를 처리하여 리보솜을 고정한 RNA를 당 구배에 올리고 원심 분리를 통해 RNA에 붙은 리보솜의 수대로 분획하는 실험방법이다.
기존의 연구는 리보소체의 개수에 따라 분획된 RNA의 분포를 역전사증폭이나 염기서열분석에 사용함으로서 RNA 특성과 번역활성간의 조절을 알아보았으며, 이러한 RNA와 리보솜의 관계를 통칭하여 번역체로 명명하였다. 특히 차세대 서열 분석으로부터의 염기서열분석기술의 개발은 번역체에 대한 고해상도의 분석이 가능하도록 하였다.
한편 이러한 고해상도의 분석이 가능케 하기 위해, 차세대 서열 분석을 이용한 RNA 서열분석에서 RNA는 파편화와 증폭을 거친다. 이러한 전략은 깊이가 깊은 정보를 제공하지만, 선택적 스플라이싱이나 전사 후 변형과 같은 RNA 분자 고유의 성질을 잃는다. 3세대 서열 분석 방법 중 하나인 나노포어 서열 분석은 긴 RNA 분자를 직접 분석하는 것을 가능하게 하였다. 이러한 나노포어 서열 분석과 폴리리보소체 탐색을 병합하면, RNA가 가진 여러 특성과 번역 활성에 대해 연관 분석할 수 있을 것이다.
리보솜 밀도에 의해 분획된 RNA 표본들을 나노포어 서열 분석하려면 실험과 분석 두 측면에서 최적화가 필요하다(2.2). 이 장엔 부유세포주를 이용하여세포 용해물을 추출하고 폴리리보솜 분획을 하는 방법이 자세히 서술되어있다. 또한 서열 분석 결과의 최적화된 분석 순서를 제시하였다 (2.3). 2.4장에선 리보솜 밀도에 따른 번역체의 일반적인 특성을 조사하는 방법들을 개발하였으며, 2.5장에선 다양한 번역체를 구성하는 각각의 RNA 분자를 살펴보았 다.
3세대 시퀀싱은 DNA및 RNA에 대한 단일 분자적 시야를 제공하며 새로운 지평을 열었다. 이 논문에서는 이를 이용하여 번역체를 분석하는 방법의 개념을 제시하였으며, 기존 방식에서 보였던 결과가 재현됨을 확인하였다. 다양한 생물학적 맥락에서 이 방법의 적용은 번역 조절에 대한 새로운 발견의 기회를 더욱 늘릴 수 있을 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In diverse biological context, most of phenotype is ultimately determined by expression of proteins. But quantification of protein is unusually considered because of its difficulties in accessibility and interpretation, RNAs made up of simpler information is investigated vicariously. However, those high-throughput studies depending on processing and decay of RNA cannot consider translation efficiency of those RNAs. Polysome profiling is a method to study translation activity of mRNAs.
Once each polysome fractions are collected, the translation activity of each mRNA is analyzed using various methods such as RT-PCR or deep-sequencing. Studies have been conducted to know correlation between the characteristics of RNA obtained as a result of polysome profiling and translation activity using various experimental methods.
Nowadays, development of gene expression profiling technique enables high-throughput methods in translatome. Established RNA sequencing with illumina sequencer use fragmentation and amplification to ensure enough depth with high quality.
However, this strategy causes loss of information such as alternative splicing or post transcriptional modification. On the other hand, nanopore sequencing, one of the third generation sequencing platform, allows direct long RNA sequencing. Coupling nanopore sequencing with polysome profiling, it will be possible to correlate the several features of RNAs that could only grasp each trend with existing RNA sequencing.
For preparing a library of fractionated samples, some optimizations are needed in both experiment and analysis. I’ll introduce optimized experiment methods in detail first (Section 2.2). In this part, There are contents about preparation of cell lysate using floating cell line and detailed polysome fractionation method. I also optimized analyze pipeline for those data (Section 2.3). I describe an array of novel analytic methods to investigate general features of transcripts according to ribosomal density (Section 2.4). After that, I look up respective molecular proper making up mass of diverse transcripts.
Long read sequencing experiments open a new prospect in the biology field providing single molecular view and lead to unexpected observation. In this thesis, I introduce a concept of profiling translatome in single molecule level. I confirmed reproducibility of this procedure and discovered diverse phenomenon. Further application of this method on various biological systems will provide an abundant opportunity for the discovery of unexpected translation regulations.

목차 (Table of Contents)

• Abstract 1
• Contents 4
• 1 Introduction
• 1.1 Investigate translatome using polysome profiling 1
• 1.2 Gene features as a regulator for ribosomal density 3
• 1.3 Post-transcriptional modification on eukaryotic transcriptomes as a regulator for ribosomal density 4
• 1.4 RNA modification on eukaryotic transcriptomes as a regulator for ribosomal density 5
• 1.5 Translatome profiling using nanopore direct RNA sequencing 6
• 2 Systematic approaches to investigate the translatome-wide multimodal RNA features
• 2.1 Background 9
• 2.2 Technically optimized polysome profiling steps for floating cell line and direct RNA sequencing 10
• 2.2.1 Cell lysate 10
• 2.2.2 Polysome fractionation 11
• 2.2.3 RNA extraction and sequencing 12
• 2.3 Data Procession 14
• 2.3.1 Basecalling and alignment 14
• 2.3.2 Transcriptome quantification 16
• 2.3.3 Poly(A) tail length estimation 18
• 2.4 General features of translatome 20
• 2.4.1 Profile pattern of known gene 21
• 2.4.2 Clustering transcripts based on ribosomal density 22
• 2.4.3 General features of protein transcripts 24
• 2.4.4 Poly(A) length distribution in different ribosomal density 26
• 2.5 Molecular features of translatome 29
• 2.5.1 Outlier transcripts in terms of poly(A) length 29
• 2.5.2 Translatome of alternative splicing variants 32
• 2.6 Discussion 34
• 3 Conclusion 36
• Summary (in Korean) 38
• Bibliography 40