Functional Characterization of the Interaction of EMF1-Interacting Proteins with EMF1 during Vegetative Development in Arabidopsis = 애기장대의 영양 발달에 관여하는 EMF1-Interacting protein과 EMF1의 단백질 상호작용에 대한 기능 규명

국문 초록 (Abstract)

고등 식물의 개화 시기는 개화 유도 유전자와 개화 억제 유전자에 의해 정교히 조절된다. EMBRYONIC FLOWER (EMF) 1, 2 유전자는 개화 억제 유전자로 알려져 있으며, 영양 생장 발달을 유지하는데 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 본 연구에서는, EMF1이 관여하는 식물의 영양 생장 조절 기작을 분자적으로 규명하기 위해, EMF1과 상호작용하는 단백질을 동정하였다. 분리된 EMF1-Interacting proteins (EMF1IPs) 중 EMF1IP1, 6, 8, 9을 선별하였으며, 이들 단백질은 각각 WNK kinase, B-box zinc finger protein, RING zinc-finger protein, DnaJ-domain protein으로 확인되었다. EMF1과 EMF1IP1, 6, 9 간의 상호작용을 in vitro와 식물 세포에서 확인하였으며, EMF1과 EMF1IP1, 6, 9으로 이루어지는 heterodimer는 핵에 위치하였다. Yeast two-hybrid 분석 실험을 통해, 다른 단백질과의 상호작용에는 EMF1의 중간부위와 C-말단 부위가 중요함을 확인하였다. 또한, PWNK 모티프가 포함된 EMF1IP1의 C-말단 부위, B-box zinc finger 도메인을 포함하는 EMF1IP6의 N-말단 부위가 EMF1과 상호작용하는데 관여하였으며, 이와 달리 EMF1과의 상호작용을 위해서는 EMF1IP8과 EMF1IP9의 전체가 필요함을 알 수 있었다. 한편, EMF1은 EMF2와 직접적인 상호작용을 하지 않지만 EMF1-EMF1IP9-EMF2 단백질 복합체의 형성을 통해 EMF2와 상호작용함을 확인하였다. 또한 EMF1-EMF1IP9 dimer와 EMF1-EMF1IP9-EMF2 단백질 복합체는 핵에서 granule 모양으로 분포함을 알 수 있었다.
EMF1, EMF1IP1, 6, 9의 유전자 발현 분석 결과, EMF1과 EMF1IP1, 6, 9은 영양 생장 발달 시기 동안 유사한 발현 양상을 나타냈다. 성숙한 식물체에서는 EMF1IP1, 6, 9의 발현은 잎과 줄기에서 강하게 나타나지만, 꽃 기관에서는 약하게 발현됨을 확인하였다. 그리고, emf1ip1, emf1ip9¬ 돌연변이는 야생형에 비해 이른 개화를 보였으며, 이들 돌연변이체에서는 FT, PI, AG의 발현이 크게 증가하였고, SOC1, CO의 발현은 약하게 증가하였다. 이와 반대로, EMF1IP1, 6, 9 과발현 형질전환체는 늦은 개화를 보였으며, FT, SOC1, PI, AG의 발현이 야생형 보다 감소한 것을 확인하였다. 본 연구의 결과를 통해, EMF1은 다양한 EMF1IP 단백질들과 상호작용을 통해 애기장대의 개화 시기 조절에 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.

목차 (Table of Contents)

• INTRODUCTION 1
• MATERIALS AND METHODS 5
• Plasmid construction 5
• Yeast two-hybrid assay 7
• Yeast three-hybrid assay 7
• Pull-down assay 7
• Transient gene expression in Arabidopsis protoplasts onion epidermal cells 8
• Plant materials and growth condition 9
• Plant transformation and selection of transgenic plants 10
• GUS assay analysis 10
• RNA isolation 10
• Semi-quantitative RT-PCR and quantitative RT-PCR 11
• Generation of double mutants 13
• RESULTS 16
• EMF1IP1, 6, 8 or 9 interact with EMF1 16
• EMF1 interacts with EMF1IP1, 6 or 9 in vitro and in plant cells 18
• The middle and C-terminal regions of EMF1 are involved in the interactions with EMF1IP1, 6, 8 or 9 20
• EMF1IP1, 6, 8 and 9 are predicted to encode a WNK kinase, a B-box zinc-finger protein, a RING-zinc finger protein and a DnaJ-domain protein, respectively 27
• C-terminal region of EMF1IP1 and B-box zinc-finger domain of EMF1IP6 are involved in the interaction with EMF1 35
• EMF1-EMF1IP9 dimer was dispersed in a granule-like pattern 41
• EMF1IP1, 6 and 9 do not interact with each other, and do not form ternary protein complexes 41
• EMF1IP1, 6 or 9 are localized in the nucleus 41
• EMF1 interacts with EMF2 via EMF1IP9 forming a ternary protein complex in the nucleus 46
• EMF1IP1, 6 and 9 showed similar expression pattern as EMF1 55
• EMF1IP1, 6 and 9 are required for proper regulation of vegetative development and flowering time 60
• DISCUSSION 78
• REFERENCES 89
• ABSTRACT (in Korean) 105
• 감사의 글 108