Development of cartilage tissue engineering applications using mesenchymal stem cells = 줄기세포를 활용한 관절조직 재생용 조직공학 제재 개발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Osteoarthritis (OA) is a common chronic disease caused damage on focal area of the articular cartilage and caused by extreme exercise and aging. Current surgical treatments for OA had a series of disadvantages such as fibrocartilaginous tissue formation and donor site morbidity. Therefore, in order to overcome these problems, researchers developed advanced treatments with the aid of mesenchymal stem cell (MSCs) including (bone-marrow derived stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cell (ADSCs)). Recent stem cell therapies based on tissue engineering and regenerative medicine have been developed combining with scaffolds and exogenous growth factors. MSC has self renewal ability and multipotency that can differentiate into bone/cartilage tissue, and is well known for pro-inflammatory effect within inner body conditions. Additionally MSC can be isolated easily from bone-marrow or adipose tissue with high yields. Therefore, it has been used as a common cell source utilized under various conditions in tissue engineering. For enhanced stem cell differentiation, exogenous growth factors (GFs) are administrated by using various delivery carriers (i.e., micelle, liposome, synthetic polymeric platform etc.). Especially, transforming growth factor-beta family (TGF-β) and insulin-like growth factor (IGF) are widely used as an exogenous growth factor for chondrogenesis of stem cell. IGF-1 and TGF- β could enhance the chondrogenesis of stem cells by developing morphological changes and inducing excretion of extracellular matrix (ECM) components. Hence, tissue engineering strategies for chondrogenesis of stem cells have been developed by varying (1) cell culture methods, (2) exogenous biological cues, (3) composition of ingredients, and (4) modification of scaffolds. This article summarized engineering applications for cartilage regeneration using stem cells, by suggesting (1) co-culture stratgies using MSC and chondrocytes, (2) recent clinical trials for ADSC-mediated joint repair, and (3) optimization of serum types (i.e., bovine serum (BS), new-born calf serum (NCS)) for enhanced chondrogenesis of ADSC. Administration of a single cell population of either stem cells or chondrocytes does not guarantee a full recovery of cartilage defects. Therefore, current tissue engineering approaches using co-culture techniques have been developed to mimic complex and dynamic cellular interactions in native cartilage tissues and facilitate changes in cellular phenotypes into chondrogenesis. Therefore, this article introduces recently developed co-culture systems using two major cell populations of, MSCs and chondrocytes. Furthermore, the present article also summarizes the recent clinical applications utilizing ADSC and its clinical and therapeutic efficacy which evaluated by scoring systems for OA treatment. Current ADSC treatments in clinical system have been developed by direct injection of ADSC with additional compounds such as platelet-rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) for enhancing differentiation of stem cells. In addition, optimization of serum types for a large-scale stem cell production/culture is also critical parameter to develop a cost-effective and biologically functional chondrogenesis process. Fetal bovine serum (FBS) is the most essential supplement in culture media for cellular proliferation, metabolism, and differentiation. However, due to a limited supply and subsequently rising prices, a series of studies have investigated a biological feasibility of replaceable serums to substitute FBS. Along with the increasing interests to manufacture stem cell-based cellular products, optimizing the composition of culture media including serums and exogenous GFs is of importance. Hence, the effect of BS and NCS on proliferation and chondrogenic differentiation capacity of human ADSCs was evaluated, especially in the chondrogenically supplemented culture condition. Our findings demonstrated that (1) co-culture methods using stem cells with chondrocytes could effectively augment chondrogenesis and stem cell differentiation as compared with monoculture, (2) clinical ADSC treatment could be an effective cell therapy by improving physical function of damaged cartilage sites, and (3) serum types and exogenous supplements of GFs could also be important parameters to optimize culture media composition, especially in order to maintain the enhanced levels of both proliferation and chondrogenic differentiation of ADSCs during expansion. Therefore, it could be speculated that stem cell therapy utilizing stem cell population could be an effective OA treatment in tissue engineering and regenerative medicine.

국문 초록 (Abstract)

골관절염은 흔한 만성 질환으로 관절 연골의 국소 부위에 손상을 주며 심한 운동과 노화로 인해 생기는 질병이다. 관절의 특성상 한번 다치면 회복되기 어렵다는 점으로 인해, 관절을 치료하기 위해서는 물리적, 외과적 방법들이 이용되고 있다. 현재 사용하고 있는 골관절염의 치료 방법들은 (미세 천공술, 관절세포 이식 등) 공여 부위의 또 다른 관절염 유발이 된다는 것과 섬유조직으로 잘못 재생되는 것과 같은 많은 단점을 가지고 있다. 따라서 이 문제를 극복하기 위해 연구자들은 앞서서 중간엽 줄기 세포와 지방 세포 유래 줄기 세포를 활용한 치료법을 개발했다. 중간엽 줄기 세포는 뼈 / 연골 조직으로 분화 할 수 있는 능력과 자가 재생 능력을 가지고 있으며, 신체 내부에 이식 되었을 때에는 염증을 억제하는 효과까지 있다고 잘 알려져 있다. 또한 중간엽 줄기 세포는 혈액이나 지방 조직으로부터 쉽게 분리 될 수 있고 그 수율 또한 다른 줄기세포에 비해 높다는 장점으로 인해 조직 공학 분야의 다양한 조건에서 활용되는 일반적인 세포원으로 사용되어왔다. 줄기 세포의 분화 가능성을 높여 주기 위해, 일반적으로 많은 연구가 다양한 전달 매체 (엑소좀, 리포솜, 합성 중합체 등)에 외인성 성장 인자를 담지 하여, 줄기세포와 함께 투여한다. 특히, 줄기 세포의 연골 형성을 위한 외인성 성장 인자로는 형질전환생장인자-베타 계열과 인슐린 유사 성장 인자가 널리 사용된다. 이전의 많은 연구에서 형태학적 변화를 일으키고 세포 외 기질 성분의 배설을 유도함으로써 줄기 세포의 연골 형성을 향상시킬 수 있는 인슐린 유사 성장 인자와 형질전환생장인자-베타의 효능을 제안했고, 따라서 줄기 세포를 활용한 연골 형성 전략은 (1) 세포 배양 방법, (2) 외인성 성장 인자의 첨가, (3) 성분 조성의 변화, (4) 지지체의 개발과 같은 방향으로 개발되었다. 이 논문에서는 (1) 중간엽 줄기 세포와 연골 세포를 이용한 공동 배양법, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용한 임상 시험 및 결과, 그리고 (3) 중간엽 줄기세포를 이용한 연골 재생 전략을 요약하고 소개하고 있다. (1)에서는 줄기 세포 또는 연골 세포와 같은 단일 유형의 세포 집단을 환부에 투여한다고 해서 연골 결손의 완전한 회복이 보장되는 것은 아니다. 따라서 공동 배양 기술을 사용하는 조직 공학적 접근법은 생체 연골 조직에서의 복잡하고 역동적인 세포 상호 작용을 모방하고 있으며, 세포 표현형의 연골 형성으로의 변화를 촉진하기 위해 개발되었다. 따라서 이 주제는 최근에 개발 된 두 가지 주요 세포 집단 (중간엽 줄기 세포 두 종류와 연골 세포 등)을 이용한 공동 배양 시스템을 소개한다. 다른 한편, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포는 손상된 연골 부위를 치료하기 위해 임상 분야에서 이용되어 왔다. 이 부분에서는 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용하여 임상에 적용시켰다. 채점 시스템으로 평가 하여 임상 효능을 요약했다. 또한 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해 혈소판 풍부 혈장 및 지방조직 유래 세포기질 분획과 같은 추가 화합물을 지방 세포 유래 줄기 세포와 주사하여 임상 시스템에서의 현재 지방 세포 유래 줄기 세포 치료법이 개발되었다. 또한 송아지 혈청과 소 혈청을 사용하여 다른 접근 방식을 도입했다. (3)에서는 혈청에 따른 지방 세포 유래 줄기 세포의 연골 세포로의 분화 효과를 확인하기 위해, 송아지 혈청과 소 혈청을 처리하여 기존에 사용하고 있는 소 태아 혈청과 비교하였다. 소 태아 혈청은 세포 증식, 신진 대사 및 분화를 위한 배양 배지에서 가장 필수적인 보충 물이다. 그러나 제한적인 공급과 그에 따른 가격 상승으로 인해 일련의 연구가 소 태아 혈청을 대체 할 수 있는 대체 가능한 혈청의 생물학적 타당성을 연구했다. 줄기 세포 기반 세포 제품을 제조하는 데 대한 관심 증가와 함께 혈청 및 외인성 성장인자를 포함한 배양 배지의 조성을 최적화하는 것이 중요하다고 여겨지고 있어, 이 실험에서 인간 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식 및 연골 분화 능력에 대한 송아지 혈청과 소 혈청의 효과가 평가되었으며, 특히 연골 보충 배양 조건에서 평가되었다. 연구 결과 (1) 연골 세포를 이용한 줄기 세포를 이용한 공 배양 방법이 단일 배양법에 비해 줄기 세포 분화에 효과적인 연골 형성이 될 수 있음, (2) 줄기 세포를 이용한 임상에서의 지방 세포 유래 줄기 세포 치료가 통증, (3) 송아지 혈청과 소 혈청은 소 태아 혈청과 비교하여 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식에는 영향을 미쳤지만, 연골 세포로의 분화 분석한 결과에서는 기존의 혈청과 차이가 나지 않았다. 이러한 연구결과들은 다양한 연골재생치료제의 개발 방향에 많은 단서를 던져주고 있고, 따라서 지방 세포 유래 줄기 세포 혹은 골수유래 중간엽 줄기세포를 이용한 줄기 세포 치료가 향후에 효과적인 골관절염 치료가 될 수 있음을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Introduction 1
• 1.1 Background 1
• 1.2 Research Trends in Tissue Engineering and Regenerative Medicines Using Stem Cells 1
• Chapter 2. Engineered Co-culture Strategies Using Stem Cells for Facilitated Chondrogenic Differentiation and Cartilage Repair 2
• 2.1 Introduction 2
• 2.1.1 Facilitated Chondrogenesis for Repairing Cartilage Defects 2
• 2.1.2 Cellular Sources in Cartilage Tissue Engineering 3
• 2.1.3 Exogenous Growth Factors for Facilitated Chondrogenic Differentiation 4
•   2.2 Engineered Co-culture Strategies Using Bone-marrow derived Mesenchymal Stem Cells and Chondrocytes 4
• 2.3 Co-culture Techniques Using Adipose-derived Stem Cells and Chondrocytes 9
• 2.4 Co-culture Applications Using Other Multiple Cell Types 11
• 2.5 In vivo Administration of Co-cultured Cells for Cartilage Tissue Regeneration 14
• 2.6 Summary 19
• Chapter 3. Recent Advances in Clinical Human Trials of Adipose-Derived Stem Cell Administration for Cartilage Repair 21
• 3.1 Introduction 21
• 3.2 Clinical Evaluation of Knee Function using Various Scoring Systems 22
• 3.3 Current Clinical Approaches in Stem Cell Administration for Cartilage Repair 28
• 3.4 Summary 36
• Chapter 4. The Effect of Serum Types on Chondrogenesis of Adipose-derived Stem Cells 38
• 4.1 Background 38
• 4.2 Materials and Methods 40
• 4.2.1 ADSC expansion and culture 40
• 4.2.2 Viability & Proliferation of ADSCs 42
• 4.2.3 DMMB assay 44
• 4.2.4 Alcian blue 44
• 4.2.5 Real-time polymerase chain reaction 44
• 4.2.6 Statistical analysis 45
• 4.3 Results 45
• 4.3.1 Morphology and viability of adipose-derived stem cells 45
• 4.3.2 Proliferation of adipose-derived stem cells 48
• 4.3.3 Chondrogenic gene expression profiles 48
• 4.3.4 Quantification and histological staining of glycosaminoglycans 51
• 4.4 Conclusion 55
• Chapter 5. Conclusion 56
• Reference 57