제브라피쉬 배아에서의 유기 염소계 살충제 물질의 개별 및 복합물에 의한 미토콘드리아 기능 장애 = Mitochondrial Dysfunction of the Individual Organochlorine Pesticides and their Mixture in Zebrafish embryos

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Organochlorine pesticides (OCPs) are known to cause fertility reduction, nervous system demage, and endocrine disorder. The OCPs, prohibited in the 1970s, still being detected in human and environmental samples. The toxicological studies for mitochondrial dysfunction are limited on individual OCPs and their mixtures which could reflect actual exposure condition.

The effects of mitochondrial disorder were evaluated in dechorinated zebrafish embryos exposed to individual 5 OCPs (i.e., p,p-DDT, Chlordane, Heptachlor, Hexachlorobenzene (HCB), and beta-hexachlorocyclohexane (beta-HCH)), and their mixtures. Target chemicals were selected by considering the biomonitoring data of POPs (Persistent Organic Pollutants) in human blood samples. The developmental toxicity testing was performed to decide concentrations for following analyses, the concentrations determined were 0.05, 0.1, and 0.5 mg/L. Oxygen consumption rate (OCR) was measured using Seahorse XFe Extracellular Flux Analyzer at 24 hpf. In addition, mRNA expression of transcription factors (i.e., PPAR-alpha, Acox1, SDHA, MCAD, and CS), associated with mitochondrial metabolism, was measured at 72 hpf.

In OCR results, the amount of the basal respiration and ATP production significantly decreased at 0.5 mg/L of chlordane and Beta-HCH. Mitochodnrial capacity reduced at lower concentration of OCPs in embryos exposed to mixture, than exposed to individual OCPs. In the result of mRNA gene expression, exposure to DDT and chlordane significantly up-regulated the level of Cs and MCAD, associated with citrate synthase and fatty acid beta-oxidation, respectively. The expression of SDHA gene, involved in the TCA cycle and respiratory chain, increased at 0.05 and 0.1 mg/L of Heptachlor and Chlordane, respectively. However, the expression of SDHA reduced at mixed OCPs concentration of 0.05 and 0.5 mg/L.

This study demonstrates that individual OCPs and their mixtures have the potentials in mitochondrial dysfunction. Furthermore, mitochondrial dysfunction measured by OCR was observed at lower concentration in embryos exposed to mixture, than exposed to individual, although the changes in gene expression were disappeared when OCPs mixtures were exposed. This study could suggest the efficient utilization of embryonic zebrafish model for evaluating metabolic effects of target chemical. Further studies will be followed for measuring the activity of the mitochondrial complex protein and estimating the dys-regulation of glucose uptake.

국문 초록 (Abstract)

유기 염소계 살충제 (Organochlorine pesticides, OCPs)는 생식능 저하, 비정상적인 호르몬 대사, 신경계 손상 등의 심각한 부작용이 있는 난분해성 물질이다. 1970년도에 이미 사용과 제조가 금지되었는데도 불구하고 여전히 생체 및 환경시료에서 검출되고 있다. 기존의 미토콘드리아 대사 기능을 분석한 독성 연구들은 실험 대상물질의 개별적인 영향을 분석한 경우가 많고, 복합물 의 영향을 분석한 연구결과는 아직도 많이 부족하다. 실제 환경에서는 대부분 복합물 형태로 존재하고 있기 때문에, 실제 노출 조건인 복합물 형태의 노출 영향을 평가하는 것은 반드시 필요하다.

본 연구에서는 제브라피쉬 배아 모델을 활용하여 복합물 노출에 의한 대사의 장애영향을 확인하고, 개별물질과 비교평가해 보고자 하였다. 실험 대상물질은 일반 인구 집단의 혈액에서 분석된 OCPs 농도 결과를 바탕으로, 농도와 검출률이 높은 p,p-DDT, Chlordane, Hexachlorobenzene (HCB), Beta-Hexacyclohexance (Beta-HCH), 그리고 Hetachlor로 총 5개 물질을 선정하였다. 개별 및 혼합물 노출에 의한 제브라피쉬 배아독성결과를 고려하여 0.05, 0.1, 그리고 0.5 mg/L를 미토콘드리아의 대사영향을 분석할 때 적용할 농도 값으로 설정하였다. 대상물질은 분석 시 모두 6 hpf (hours post fertilization)에서 노출시켰다. Seahorse XFe Extracellular flux analyzer 분석장비를 사용하여 24 hpf의 배아에서 산소소비량을 측정하고, 미토콘드리아의 활성 (activity)과 조절 능력을 평가하였다. 미토콘드리아의 대사 조절 및 베타 산화과정 (β-Oxidation)과 관련된 유전자 (PPAR-alpha, Acox1, SDHA, MCAD, 그리고 Cs)의 발현수준을 72 hpf에서 추출된 DNA로 분석하여 전사인자상의 영향을 파악하였다.

산소소비량을 측정한 결과, Chlorodane의 0.5 mg/L에서 기초 호흡 (Basal repiration)과 ATP 생산(production) 능력이 유의하게 감소 (p-value< 0.05)하였고, Beta-HCH의 0.5 mg/L에서 basal respiration의 유의한 감소가 나타났다. 또한 복합물의 0.05과 0.1 mg/L에서 기초호흡량과 ATP 생산, 최대 호흡량이 저해되는 결과가 나타났다. OCPs 노출된 그룹은 대부분 대조군에 비해 산소소비량이 감소하였다. 또한 OCPs에 노출된 배아에서 각각의 유전자 발현수준을 비교한 결과, DDT와 Chlordane에서 모두 MCAD와 Cs 유전자 발현이 유의하게 증가하였고, SDHA 유전자는 Chlordane의 0.1 mg/L과 Heptachlor의 0.05 mg/L에서 유의하게 증가하였다. 그리고 복합물에 노출된 배아에서는 0.05와 0.5 mg/L에서 SDHA 유전자가 유의하게 감소하였다.

본 연구를 통해, OCPs의 개별 및 복합물에 노출이 미토콘드리아의 전자전달계의 활성과 미토콘드리아의 대사 조절에 장애 영향을 일으킬 수 있음을 확인하였다. 또한 미토콘드리아의 대사 기능을 제브라피쉬 배아모델을 활용하여 충분히 평가할 수 있었다. 이를 바탕으로, 향후에는 미토콘드리아 Complex 기능 분석과 당 섭취능 평가를 진행하여 OCPs 물질이 대사 장애를 일으키는 기전을 연구하고자 한다.

목차 (Table of Contents)

• 요약 ⅰ
• 표목차 ⅲ
• 그림목차 ⅲ
• 사진목차 ⅳ
• Ⅰ. 서 론 1
• 1. 연구의 목적 및 필요성 1
• Ⅱ. 이론적 고찰 3
• 1. 잔류성 유기오염 물질의 정의 및 특징 3
• 2. 미토콘드리아의 기능 및 역할 7
• 3. 제브라피쉬 배아 모델 11
• 4. 유기염소물질에 의한 대사 질병의 대표적인 예시: 제2형 당뇨 16
• Ⅲ. 실험장치 및 실험방법 27
• 1. 대상물질 제조방법 및 농도 27
• 2. 제브라피쉬 배아 독성평가 방법 31
• 3. 산소소비량 (Oxygen Consumption Rate, OCR) 분석방법 33
• 4. 미토콘드리아 기능관련 유전자의 발현비교 39
• Ⅳ. 실험 결과 및 고찰 42
• 1. OCPs에 의한 발달독성평가 42
• 2. 산소소비량 (OCR) 분석법 46
• 3. 미토콘드리아 기능관련 유전자 발현영향 확인 56
• Ⅴ. 결론 63
• 참고문헌 64
• 영문초록(Abstract) 67
• 감사의 글 69