(The) protective effects of the genus Orobanche on UVB-induced skin damage

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Orobanche, also known as broomrape, is a genus that contains over 200 species of parasitic herbaceous plants. Some of them have been used as Traditional Chinese Medicine for thousands of years. However, no studies reported the protective effects of the species of the genus Orobanche on UV-induced photodamage.
The purpose of this study was to investigate the effects of eight Orobanche species including O. aepyptiaca, O. amoena, O. cernua, O. clarkei, O. coerulescens, O. megalantha, O. pycnostachya and O. yunnanensis, as well as their active components such as crenatoside, acteoside, isoacteoside and 2’-acetylacteoside on UVB-induced photodamage with the aim of developing novel application in cosmetics and foods industry.
The photoprotective effect of Orobanche species were investigated using UVB-irradiated HaCaTs. The MMP-1 and procollagen type I mRNA were examined by RT-PCR. The secretion of MMP-1 and TARC were detected by ELISA kits. The DNA damage and cell apoptosis were measured by comet assay and flow cytometry, respectively. The related signaling pathway was carried out using western bloting.
The results indicated that four species (O. cernua, O. coerulescens, O. pycnostachya and O. yunnanensis) effectively prevented UVB-induced photoaging by reduction of matrix metalloproteinases-1 (MMP-1), ROS expression and stimulation of procollagen synthesis. Additionally, O. pycnostachya and O. yunnanensis species were found to alleviate UVB-induced DNA damage and cell apoptosis. Thymus and activation regulated chemokine (TARC/CCL17) is produced in response to pro-inflammatory cytokines, which is implicated in the development of skin inflammatory diseases such as atopic dermatitis. In this study, UVB radiation was found to significantly stimulate TARC secretion, but this secretion could be inhibited by O. pycnostachya and O. yunnanensis post-treatment. Overall, O. pycnostachya and O. yunnanensis were the most effective species against UVB-induced photodamage. In depth examination indicated that the photoprotection mechanisms of O. pycnostachya and O. yunnanensis were involved in regulation of MAPK/AP-1, NF-κβ, TGF-β/Smad and Nrf2 signaling pathways.
The active components of Orobanche species were analyzed by HPLC method. Crenatoside, acteoside, isoacteoside and 2’-acetylacteoside were detected from Orobanche species. Consistent with the results of Orobanche species, acteoside, isoacteoside and 2’-acetylacteoside was also found to decrease UVB-induced MMP-1 expression and stimulate type I procollagen synthesis through inhibition of MAPK/AP-1 and activation of TGF-β/Smad pathway. By comparing the data, acteoside and 2’-acetylacteoside have higher efficiency than isoacteoside on regulation of signal cascades mentioned above. Moreover, acteoside and 2’-acetylacteoside significantly inhibited UVB-activated NF-κβ and promoted Nrf2 antioxidant defense system, which suggested that acteoside and 2’-acetylacteoside might be the major active ingredients contributed to the photoprotective effects of Orobanche species.
In conclusion, the species of the genus Orobanche, especially O. pycnostachya and O. yunnanensis, have great potential in alleviating UVB-induced photodamage. The acteoside and 2’-acetylacteoside, as main active components from Orobanche species, were more effective than crenatoside and isoacteoside in regulation photodamage. The Orobanche species and their active ingredients might be promising agents against UV radiation induced skin damage, which might provide a new strategy for improvement skin photodamage.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

皮肤是我们人体最大的器官，它不仅可以感知冷暖，压力等外界刺激，还可以保护我们身体组织、器官免于外界物理性，化学性及病原微生物的入侵。随着年龄不断地增长皮肤会逐渐老化，除了自然老化外，我们的皮肤还不断遭受外界环境的损害。紫外线损伤是外源性损伤的主要因素，自然界中的紫外线辐射主要来源于太阳光，因此该损伤又称为光损伤。根据其波长的不同，紫外线可分为长波紫外线 UVA（320-400nm），中波紫外线 UVB（280-320nm）及短波紫外线 UVC（200-280nm）。在相同剂量条件下，UVC 对皮肤的损害性最强，其次是 UVB，UVB 对皮肤的损伤强度比 UVA 强约 800-1000 倍。在这三个波段的紫外线中，UVA 的穿透性最强，能够到达真皮层。其次是UVB，它能照射至表皮及真皮上表皮层。而 UVC 穿透性最弱，在穿过大气层时几乎被臭氧层吸收，基本到达不到地面。综合看来光损伤主要由 UVA 和 UVB 引起，而 UVB是最主要的因素。光损伤的临床表现为皮肤免疫功能抑制, 黑素沉积, 皮肤光敏反应、光老化、日光性角化病、皮肤癌等。大量研究表明紫外线对皮肤的损伤与其产生的活性氧簇 (reactive oxygen species, ROS) 造成的氧化应激有关。正常情况下，机体内的 ROS 能被皮肤细胞内的抗氧化系统(包括酶和非酶) 转化、消除，当紫外线的照射过量时，机体内会形成大量的 ROS，打破体内抗氧化系统的平衡， 从而导致氧化应激的发生。过多的 ROS 可引起皮肤组织内脂质、DNA、蛋白质等成分损伤，破坏皮肤细胞的结构及各种生物代谢功能，从而诱发一系列皮肤疾病。近年来，随着大气中臭氧层的变薄以及人类户外消闲活动的增多, 越来越多的人们遭受紫外辐射带来的损伤。因此开发具有高活性，低毒的天然成分的防晒产品对抗外界辐射，缓解皮肤光损伤已成为目前医学研究的热点。列当属（Orobanche）为列当科 （Orobanchaceae）最大的属，全世界拥有 200 多个物种，大多分布于北温带，少数分布于美洲南部和非洲东部。我国产 25 种，主要分布于东北、内蒙古、陕西、宁夏、西藏，新疆等地区。本属的列当，弯管列当，黄花列当，滇列当，大花列当及毛药列当作为传统的民族药广泛被利用，具有补肾壮阳，强筋健骨的功效。 由于其与肉苁蓉具有相似的功效，也常作为肉苁蓉的代用品。现代药理研究也表明该属植物具有抗氧化，抗菌，抗炎，提高免疫等功效。复杂的化学成分是植物多种生物活性的物质基础。研究表明列当属植物次生代谢产物丰富，含有苯乙醇苷 (phenylethanoid glycosides)，木质素，萜类等化学成分，其主要活性物质为苯乙醇苷类。 苯乙醇苷类化合物是一类含有羟基、甲氧基取代苯乙基和羟基、甲氧基取代肉桂酰基，通常以β-葡萄糖为母核的含有酯键及氧苷键的天然糖苷。药理研究显示苯乙醇苷类化合物具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、保肝、抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗病毒、增强记忆等多种生物活性。该类化合物含有的酚羟基，能够有效的结合体内的自由基，对自由基带来的氧化损伤具有很好的抑制效果，是抗衰老和抗氧化的重要成分。虽然列当属物种作为民族药历史悠久，但未见其抗光损伤方面的报道。丰富的苯乙醇苷类化合物赋予该物种抗氧化，抗衰老的潜能，为了更好的利用该资源，本文进一步探讨了该属常见物种以及其主要的活性成分对紫外辐射损伤的保护作用，该研究可为新资源及新药开发奠定一定基础。

국문 초록 (Abstract)

배경소개：열당속은 열당과에 속하는 200 여 종의 기생초본식물을 포함하는 속이다. 그 중의 일부 종들은 전통적인 민간약으로 사용해왔고 이미 몇 천 년의 역사를 가지고 있다. Phenylethanoid glycoside 류 화합물은 열당속 식물의 주요 활성성분이며 이 성분은 다양한 생물의 활성을 부여하여 항산화, 항염, 항균, 간 보호 작용 등 약용 영역에서 광범위한 응용가치를 가지고 있는 성분이다. 그러나 광 손상의 보호작용에 대한 관련 연구는 전무하다. 이 때문에 본문은 열당속의 흔한 종들 및 활성 성분이 자외선 유도 손상에 보호작용을 깊이 연구하여 새 자원 및 신약개발을 기초를 다지다.
재료방법：생산지에 따라 열당속에 속하는 흔한 종을 8 개 수집하여 건조 샘플을 분쇄 후 70% 알코올으로 상온에서 48 h 추출한다. 얻은 추출물을 여과, 농축, 동결건조, 순으로 진행 한 후 샘플을 얻었다. HPLC 법을 이용하여 샘플에서 phenylethanoid glycosides (crenatoside, acteoside, isoacteoside 과 2‟-acetylacteoside) 의 함량을 분석했다. 우선 DPPH 법을 이용하여 샘플의 항산화 활성을 초보적 분석을 진행한다. 그 다음에 MTT 법, Flow cytometry, DCFH-DA 법 및 comet assay 을 이용하여 샘플의 세포 활력, 세포조망, DNA 손상 및 세포 활성산소의 조절작용을 각각 평가했다. 더 나은 샘플을 선발하기 위하여 우리는 RT - PCR 법 및 ELISA KIT 기술을 이용하여 실험샘플의 MMP-1, Type I procollagen 및 TARC 인자의 조절작용을 검측했다. 결과를 비교하여 뚜렷한 효과가 있는 종이 Western blot 검출 기술을 이용해 샘플의 신호통의 조절을 분석하여 분자 생물학 차원에서 광 보호 메커니즘을 검토 했다.
실험결과 및 결론 ： 실험결과는 다음과 같다. O. cernua, O. coerulescens, O.pycnostachya 및 O. yunnanensis 는 UVB 의 방사 유도 피부 노화를 효과적으로 완화시킨다. UVB 의 낮춰기를 통해 MMP-1, ROS 의 표현을 일으키며 Type I procollagen 의 합성을 촉진시켰다. 또한 O. yunnanensis 및 O. pycnostachya 는 UVB 에 대한 세포 DNA 손상 과 세포조망을 일으키는 것을 억제효과 나타났다. TARC/CCL17 은 케모카인가 유도한 추세인자로 피부질환에 예를 들면 알레르기성 피부염과 같은 역할을 하고 있다. 본 연구에서 UVB 의 방사능은 TARC/CCL17 의 분비를 향상 시킬 수 있다는 것을 발견하고 이런 분비는 O. yunnanensis 및 O. pycnostachya 이 억제 시킬 수 있다. 종합적인 결과는 O. yunnanensis 및 O. pycnostachya 이 UVB 유도 광손상에 최적의 복구 효과가 있다는 것을 발견하였다. 연구결과는 O. yunnanensis 및 O. pycnostachya 의 항 광 손상 메커니즘 및 조절은 MAPK/AP-1，NF-κβ，TGF-β/Smad 및 Nrf2 의 신호통로랑 연결되어 있는 것을 발견된다. HPLC 검출 분석을 통해 crenatoside, acteoside, isoacteoside, 2‟-acetylacteoside 은 열당속 물종의 주요 성분을 발견된다. 활성연구에 따르면 crenatoside 와 isoacteoside 비교하여 acteoside 와 2‟-acetylacteoside 는 더 효과적인 MAPK/AP-1 를 억제 할 수 있다. 그리고 TGF-β/Smad 통로를 인상하여 UVB 감소에 유발된 MMP-1 인상 및 콜라겐 합성의 감소를 효과적인 감축 시킬 수 있다. 또한 acteoside 와 2‟-acetylacteoside 는 효과적으로 UVB 유발된 NF-κβ 의 활성화를 억제 하고 Nrf2 항산화 방어 체계 활성을 인상 시킨다. 이런 결과에는 acteoside 및 2‟-acetylacteoside 는 당뒤속 물종이 항 광손상의 주요 활성성분이다.
총괄적으로 말하면 본 연구 결과에 열당속 물종 및 활성 성분에 대한 UVB 유도 방사손상을 일정 조절 역할을 할 수 있는 것을 증명하여 기능성 식품 및 화장품 산업에 활용 가능할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 1
• 1. The genus Orobanche, parasitic herbaceous plants 1
• 1.1. Distribution and classification 1
• 1.2. Phytochemical constituents from Orobanche species. 2
• 1.2.1. Phenylethanoid glycosides. 2
• 1.2.2. Lignans 2
• 1.2.3. Sterides 3
• 1.2.4. Organic acids 3
• 1.3. Pharmacological activities of Orobanche species 3
• 2. Skin structure and UV-induced photodamage 12
• 3. The pathogenesis of skin photodamage 16
• 3.1. Oxidative stress, DNA damage and cell apoptosis 16
• 3.2. MAPK/AP-1, NF-κβ mediated MMPs production 19
• 3.3. Impaired TGF-β/Smad inhibited type I procollagen synthesis 21
• 3.4. TARC expression 23
• 4. Purpose of study 26
• II. Materials and Methods 28
• 1. Materials 28
• 2. Methods 29
• 2.1. Preparation of eight Orobanche species extracts 29
• 2.2. Separation of the major compounds from O. cernua L. by High-speed counter-current chromatography (HSCCC) 33
• 2.3. HPLC analysis 36
• 2.4. Dipheny1-1-picrylhdrazyl (DPPH) scavenging activity 36
• 2.5. Cell culture 36
• 2.6. UVB irradiation and samples treatment 36
• 2.7. Cell viability 37
• 2.8. Cell apoptosis 37
• 2.9. Detection of DNA damage 38
• 2.10. Measurement of ROS production 38
• 2.11. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 39
• 2.12. Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction (RT - PCR) 39
• 2.13. Western blot analysis 41
• 3. Statistical analysis 41
• III. Results 42
• 1. Analysis of main components from Orobanche species 42
• 2. Effects of Orobanche species on UVB-induced photodamage in HaCaTs 48
• 2.1. DPPH radical scavenging activitiy 48
• 2.2. Cell viability 50
• 2.3. Cell apoptosis 52
• 2.4. DNA damage 54
• 2.5. ROS production 56
• 2.6. MMP-1 production measured by ELISA kit 58
• 2.7. TARC production measured by ELISA kit 60
• 2.8. The mRNA expression of MMP-1 and Type I procollagen mRNA analyzed by RTPCR 62
• 2.9. Signaling pathway detected by western blot 65
• 2.9.1. AP-1 pathway 65
• 2.9.2. MAPK pathway 67
• 2.9.3. MAP kinase inhibitors 69
• 2.9.4. NF-κβ/ Iκβα pathway 71
• 2.9.5. TGF-β/Smad pathway 73
• 2.9.6. Nrf2 pathway 75
• 3. Effects of the major components from Orobanche species on UVB-induced photodamage in HaCaTs 77
• 3.1. DPPH radical scavenging activity 77
• 3.2. Cell viability 79
• 3.3. ROS production 81
• 3.4. MMP-1 production detected by ELISA kit 83
• 3.5. TARC production detected by ELISA kit 85
• 3.6. MMP-1 and Type I procollagne mRNA expression analyzed by RT-PCR 87
• 3.7. Signaling pathway detected by western blot 89
• 3.7.1. Effect on AP-1 pathway 89
• 3.7.2. Effects on MAPK pathway 91
• 3.7.3. Effects on NF-κβ/Iκβα pathway 93
• 3.7.4. Effects on TGF-β/Smad pathway 95
• 3.7.5. Effects on Nrf2 pathway 97
• IV. Discussion 99
• V. Conclusion 109