연근의 항산화 효과 및 렌즈 알도즈 리닥타제 저해작용과 PTP1B 효소 저해효과 = Antioxidant and lens aldose reductase and PTP1B inhibitory effects of Nelumbo nucifera Rhizomes

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Nelumbo nucifera Gaertn., a perennial aquatic plant, which was distributed throughout Asia, including India, China, the Middle east and Egypt. In particular, the rhizomes of N. nucifera, have been used foodstuffs as well as traditional medicines in China, India and Korea. Various pharmacological activities of the N. nucifera rhizomes, including antimicrobial, antioxidant, antiobese, antidiabetic, anti-Alzheimer, and antihypertensive effects have been reported. However, the diabetic complications effect of the rhizomes is unclear, and its antidiabetic and antioxidant effects is yet limited. Therefore, the preventive and therapeutic potency against oxidative stress and diabetic complications of Nelumbo nucifera were evaluated via the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), total reactive oxygen species (ROS) assays, as well as the rat lens aldose reductase (RLAR) and the human recombinant aldose reductase (HRAR) assays. In addition, the anti-diabetic effect of the rhizomes was determined via the protein tyrosin Protein tyrosine phosphatase (PTP) 1B assay.
The MeOH extract of the N. nucifera rhizome exhibited marignal antioxidant effects, however the EtOAc fraction exerted significant antioxidant effects with IC_(50) values of 3.21 and 11.06 μg/ml, by compared with respective positive controls, L-ascorbic acid (IC_(50) 5.16 μg/ml) and trolox (IC_(50) 5.19 μg/ml) in the DPPH and total ROS assays, respectively. Also, the N. nucifera rhizome showed remarkable RLAR inhibitory effects with IC_(50) values of 7.70 μg/ml, by compared with positive control, quercetin (IC_(50) 3.28 μg/ml), however, no HRAR inhibitory effects within test concentration (f.c. 50 μg/ml). Interetingly, the EtOAc and n-BuOH fractions exerted predominant inhibitory effects with respective IC_(50) values of 0.15 and 0.68 μg/ml in the RLAR assay; 10.76 and 33.95 μg/ml in the HRAR assay. In the PTP1B assay, the CH₂Cl₂ fraction, along with the AR inhibitory EtOAc and n-BuOH fractions appeared significant inhibitory effects with IC_(50) values of 4.09, 0.85, and 6.76 μg/ml, by compared with a positive control, ursolic acid (IC_(50) 1.80 μg/ml). Since tryptophan was previously isolated to be antidiabetic components, the PTP1B inhibitory effect of this compound was evaluated in this study. This component showed great PTP1B inhibitory effect with an IC_(50) value of 4.75 μg/ml.
In conclusion, the above results suggest that the rhizomes of of N. nucifera, and tryptophan contained within them, would clearly have potential uses in the development of therapeutic or preventive agents for oxidative stress, diabetic complications, and diabetes.

국문 초록 (Abstract)

민간요법이나 문헌에 그 효과가 널리 알려진 연근의 MeOH추출물 및 분획물을 이용하여 in vitro 실험을 실시하였다. 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH radical 소거 활성, 활성산소종 생성억제활성 실험을 수행하였고 당뇨병 합병증 억제 활성을 확인하기 위해 aldose reductase 억제 활성, HRAR 억제활성 실험을 실시하였으며 인슐린 감수성을 증가시켜 혈당강하 효과를 나타내는 연근의 효능을 확인하고자 PTP1B 억제활성에 대한 in vitro 실험을 수행하였다.
1. 연근의 MeOH 추출물뿐만 아니라 CH₂Cl₂, EtOAc, n-BuOH, H₂O 분획물에 대하여 DPPH radical 소거 활성, 활성산소종 생성 억제활성, Aldose reductase 억제 활성, HRAR 억제활성 및 PTP 1B 억제활성 실험을 수행하였다.
2. 연근의 DPPH radical 소거 활성은 EtOAc(IC_(50) 3.21 μg/ml), n-BuOH(IC_(50) 10.88 μg/ml) 획분에서 높은 활성을 나타내었다. 이 결과로서 연근의DPPH radical 소거 활성을 지닌 성분은 대부분 EtOAc획분과 n-BuOH획분에 존재함을 알 수 있었다.
3. 생체 내에서 생성되는 활성산소종을 정량 측정하는 방법으로 간세포주에서 생성된 활성산소종에 의해 비형광 probe인 DCFH-DA가 강한 형광성을 띠는 DCF로 전환되는 기전을 이용하여 연근의 MeOH 추출물과 CH₂Cl₂, EtOAc, n-BuOH, H₂O 분획물에 대한 활성산소종 억제효과를 측정하였다. DPPH radical 소거 활성에서도 강한 소거능을 보였던 EtOAc(IC_(50) 11.06 μg/ml), n-BuOH(IC_(50) 24.64 μg/ml) 획분에서 높은 억제효과를 나타내었다.
4. Aldose reductase 억제 활성을 확인하기 위해 연근의 MeOH 추출물과 그로부터 얻은 CH₂Cl₂, EtOAc, n-BuOH, H₂O 분획물의 활성을 검색하였다. 그 중 EtOAc 분획물의 활성은 IC_(50) 수치가 0.15 μg/ml 로 추출물과 분획물 중 가장 큰 억제활성을 나타내며, 대조약물인 quercetin의 IC_(50) 수치 3.28 μg/ml를 능가하는 강력한 억제활성을 나타냈다.
5. 연근의 MeOH 추출물 뿐만 아니라 CH₂Cl₂, EtOAc, n-BuOH과 H₂O 분획물에 대한 Human Recombinant aldose reductase 억제활성을 측정하였다. 이때 대조약물로는 대표적인 항산화제로 널리 알려져 있는 quercetin과 Aldose reductase inhibitor 로 사용되고 있는 화합물로서 succinimide 유도체인 Epalrestat를 선택하여 그 활성을 함께 비교하였다. 결과 EtOAc(IC_(50) 10.76 μg/ml), n-BuOH(IC_(50) 33.95 μg/ml) 획분에서 높은 억제효과를 나타내었다.
6. 연근의 MeOH 추출물과 CH₂Cl₂, EtOAc, n-BuOH과 H₂O 분획물에 대한 Phosphatase 1B 억제활성을 측정하였다. 이때 대조약물로는 Ursolic acid를 선택하여 그 활성을 함께 비교하였다. 그 중 EtOAc 분획물의 활성은 IC_(50) 수치가 0.85 μg/ml 로 분획물 중 가장 큰 억제활성을 나타내며, 대조약물인 Ursolic acid의 IC_(50) 수치 1.80 μg/ml에 근접하는 억제활성을 나타냈다.
이로써 연근 추출물은 천연 항산화제로서의 기능과 더불어 혈당을 강하시키고 당뇨 합병증을 예방할 수 있는 기능성 식품으로서의 가치가 있음을 나타내고 있다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험 방법 = 8
• 1. 재료 = 8
• 2. 시약 및 기기 = 8
• 2-1. 시약 = 8
• 2-2. 기기 = 8
• 3. 방법 = 9
• 3-1. 추출 및 분획 = 9
• 4. in vitro 실험 = 11
• 4-1. DPPH radical 소거활성 = 11
• 4-2. 활성산소종 생성 억제 활성 = 14
• 4-3. Aldose reuctase 억제 실험 = 19
• 4-4. Human recombinant Aldose reductase 억제 실험 = 22
• 4-5. Phosphatase 1B 억제활성 = 25
• 5. 통계처리 = 27
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 28
• 1. in vitro 실험 = 28
• 1-1. DPPH radical 소거 활성 = 28
• 1-2. 활성산소종 생성 억제 활성 = 31
• 1-3. 연근의 분획물의 aldose reductase 억제활성 = 34
• 1-4. 연근의 분획물의 Human Recombinant aldose reductase 억제활성 = 38
• 1-5. Phosphatase 1B 억제활성 = 41
• Ⅳ. 요약 및 결론 = 44
• Ⅴ. 참고문헌 = 47
• 감사의 글 = 54