기내 검정법을 이용한 국내 과수 화상병 방제제 선발 연구 = Study of control agent screening for fire blight by in vitro test

국문 초록 (Abstract)

Enterobacteriaceae에 속하는 Erwinia amylovora라는 세균에 의해 발생하는 식물세균병인 화상병은 2015년 이전에는 국내에서 발병이 보고되지 않았고 금지병해충으로 지정되어있다. E. amylovora는 장미과 식물을 기주로 삼으며 사과, 배 등 과수에 큰 피해를 주며 보통 감염된 기주는 5년 내에 나무 전체가 고사하게 된다. 국내에서는 2015년 천안, 안성의 사과 과수원에서 최초로 발생하였다. 2015년 발병 이후 농촌진흥청에서는 감염의심 나무는 즉시 매몰하고 감염 확진 시 과수원 전체와 감염 된 나무의 반경 100m이내 기주식물 매몰, 발견지점 반경 2km 이내 약제살포, 발견지점 반경 5km 이내 주기적 예찰을 실시한다. 예방 방법으로는 배나무는 3월 하순부터 4월 상순, 사과는 4월 상순에 동제 화합물 살포를 하고 병 발생 지역은 개화기에 항생제를 살포하도록 권장하고 있다. 그러나 국내에 발병된 적이 없었던 병이므로 사전 연구가 이루어지지 않아 적절한 방제약제 선정 및 방제체계가 확립되어 있지 않다. 외국의 경우 화상병을 방제하기 위하여 항생제인 streptomycin을 많이 사용하였는데 저항성을 가지는 화상병원세균 균주가 발생함에 따라 대체 항생제와 생물학적 제제를 이용한 방제를 많이 이용한다. 따라서 본 연구는 이러한 방제 방법과 다른 식물세균병에 대하여 등록되어있는 살세균제와 생물학적 제제를 활용하여 국내 화상병에 적용하기에 적절한지 검증하고 외국의 사례와 같이 streptomycin과 대체 항생제에 대해 저항성 유전자 또는 저항성 획득이 가능한지 검정하였다. 먼저 화상병 방제 후보 방제제들의 최소억제농도(MIC)를 통하여 oxytetracycline, streptomycin, sxytetracycline+streptomycin, kasugamycin, oxolinic acid와 동제 화합물인 tribasic copper sulfate와 생물학적 제제인 Bye-mycin®, Blossom protect®와 신규 길항미생물 DF49, DF52를 효과적인 화상병방제 후보 방제제로 선별되었다. in planta 실험에서는 화상병원세균의 기주인 사과의 꽃, 신초, 유과를 이용하여 각 후보 방제제들의 화상병 억제 효과와 적절한 처리시기를 제시 하고자 하였다.
그 결과 꽃에서는 항생제와 copper hydroxide가 효과가 좋았고 Blossom protect®는 효과가 있지만 항생제나 copper hydroxide보다는 효과가 떨어졌고 신초와 유과에서는 항생제와 tribasic copper sulfate가 효과적이고 생물학적 제제의 경우 효과를 보이지 않았다. 또한 미국의 화상병원세균과 같이 항생제에 대하여 저항성을 가지는지 확인하였다. Streptomycin에 대한 저항성의 경우 streptomycin을 불활성화 시키며 접합에 의하여 이동 가능한 strA-strB라는 저항성 유전자와 streptomycin의 작용부위인 ribosome의 구성성분인 12s protein을 암호화 하고 있는 rpsL에 돌연변이가 생길 경우 저항성을 가지게 되는데 두 유전자를 검정한 결과 국내 화상병원세균은 strA-strB를 가지지 않고 rpsL에 돌연변이는 발생하지 않아 streptomycin에 대하여 저항성을 가지지 않았다. 화상병원세균과 동일 서식처를 가지는 부생균이 strA-strB를 가질 경우 접합에 의해 화상병원세균이 streptomycin에 대하여 저항성을 획득 할 수 있으므로 사과 신초에서 분리된 부생균에 대하여 strA-strB를 검정하였고 그 결과 strA-strB를 가지고 있지 않았다. 기존 연구에 의하면 매개충에 의해 화상병이 전반 된다고 알려져 있지만 확인 결과 매개충들의 표면에는 발병 가능한 정도의 화상병원세균은 검출되지 않았다. 마지막으로 효과적인 항생제와 동제 화합물이 화분 매개충에 대하여 부정적 영향에 대하여 검정하였다. 접촉독성, 경구독성 및 활동성에 대한 부작용이 없는 것을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Fire blight, caused by the enterobacterial pathogen Erwinia amylovora, is a major disease of rosaceous plants include apple and pear. Fire blight has been not reported in Korea until 2015 but apple orchard in Anseong and Cheonan was occurred fire blight in early May 2015.
Because fire blight was not exist in Korea, suitable control agent and control system was not established. In Rural Development Administration(RDA), the suspect tree is buried immediately and when suspected tree confirmed fire blight the entire orchard and host plant within 100 m are buried, sprayed within 2 ㎞ radius of disease occur site, and periodically monitored within 5 ㎞ radius of disease occur site. RDA proposes to treat copper compounds in late March to early April on apple, early April on pear and antibiotics in blossoming season on orchard which confirmed to fire blight. In other countries where streptomycin resistant E. amylovora occur, alternative antibiotics and biological agent are uesd to control.
This study was performed to test whether Korea control system is suitable for Korea fire blight and to confirm whether E. amylovora has a resistance gene for streptomycin or other antibiotics. MIC was tested to screen oxytetracycline, steptomycin, oxytetracycline+streptomycin, kasugamycin, oxolinic acid, tribasic copper sulfate, Bye-mycin®, Blossom protect™, DF49 and DF52 as effective fire blight control agent, and in planta test have suggested appropriate application period for each agents. Antibiotics and tribasic copper sulfate were effective in controlling fire blight from so we confirmed same gene in E. amylovora which isolated in Korea. Epiphyte bacteria which isolated on apple shoots has no transposable resistance gene. Surface of the insect vectors was no detectable E. amylovora Finally, effective control agents were not have side effects on pollinators.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ.서 론 1
• Ⅱ.재료 및 방법 3
• 1. 화상병 방제 후보 방제제 선발 3
• 2. 국내 화상병 분리 균주 확보 및 보존 5
• 3. 후보 방제제의 억제력 검정 in vitro 6
• 1) 고체배지에서의 억제력 검정 6
• (1) 항생제 및 동제 화합물의 억제력 검정 6
• (2) 생물학적 제제의 억제력 검정 6
• 2) 액체 배지에서의 억제력 검정 7
• (1) 항생제 및 동제 화합물의 억제력 검정 7
• (2) 생물학적 제제의 억제력 검정 7
• (3) 식물추출물을 이용한 생물학적 제제의 화상병원세균 억제 관찰 7
• 4. 후보 방제제의 억제력 검정 in planta 8
• 1) 사과 꽃에 대한 후보 방제제의 억제력 검정 8
• 2) 사과 신초에 대한 후보 방제제의 억제력 검정 9
• 3) 미성숙 사과에 대한 후보 방제제의 억제력 검정 11
• 5. 항생제에 대한 저항성 유전자의 존재 확인 13
• 1) Streptomycin에 대한 저항성유전자의 존재 확인 13
• 2) Kasugamycin에 대한 spontaneous mutant 확인 15
• 6. 부생균의 strA-strB의 존재 확인 16
• 7. 매개충에 의한 화상병원세균의 확산 확인 17
• 8. 꿀벌에 대한 항생제 및 동제 화합물의 독성 검정 18
• 1) 접촉 독성 검정 18
• 2) 경구 독성 검정 18
• Ⅲ.결 과 19
• 1. 국내 화상병 분리 균주 확보 및 보존 19
• 2. 후보 방제제의 in vitro 억제력 검정 21
• 1) 고체 배지에서의 억제력 검정 21
• (1) 항생제 및 동제 화합물의 억제력 검정 21
• (2) 생물학적 제제의 억제력 검정 21
• 2) 액체 배지에서의 억제력 검정 25
• (1) 항생제 및 동제 화합물의 억제력 검정 25
• (2) 생물학적 제제의 억제력 검정 25
• (3) 식물추출물을 이용한 생물학적 제제의 화상병원세균 억제 관찰 25
• 3. 후보 방제제의 in planta 억제력 검정 30
• 1) 사과 꽃에 대한 후보 방제제의 억제력 검정 30
• 2) 사과 신초에 대한 후보 방제제의 억제력 검정 34
• 3) 미성숙 사과에 대한 후보 방제제의 억제력 검정 38
• 4.항생제에 대한 저항성 및 내성 검정 42
• 1) Streptomycin에 대한 저항성 유전자의 존재 확인 42
• 2) Kasugamycin에 대한 spontaneous mutant 확인 45
• 5. 부생균의 strA-strB의 존재 확인 47
• 6. 매개충에 의한 화상병원세균의 확산 검정 49
• 7. 꿀벌에 대한 항생제 및 동제 화합물의 독성 검정 51
• 1) 접촉 독성 검정 51
• 2) 경구 독성 검정 51
• 3)sublethal effects 51
• Ⅳ.고 찰 53
• Ⅴ.참고문헌 55