인간 중간엽 줄기세포와의 비교에 의한 인간 태아 연골유래 줄기세포의 특성분석 : Characterization of Human Fetal Cartilage - Derived Stem Cells in comparison with Human Mesenchymal Stem Cells

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mesenchymal stem cells (MSCs) delivered from various sources have been focused on cartilage tissue engineering. However MSCs have the limited capacity to fully differentiate into chondrocytes and form intact cartilage tissues. Many studies now suggest that fetal stem cells are more plastic than adult stem cells, and hence more efficient in differentiating into target organs. The aim of our study was to investigate the characteristics of fetal cells-derived cartilage tissue (FC cells) in comparison with human bone marrow (BM)-derived MSCs. Our hypothesis was that fetal cartilage-derived stem cells (FC cells) have characteristics similar to BM-derived MSCs.
Human fetal cartilage-derived stem cells (FC cells) were isolated from the human fetus at 12 weeks after gestation with the approval from IRB at Ajou University Medical Center. The cells were cultured in monolayer over passages 0 to 6 and analyzed for surface markers of human MSCs, hematopoietic stem cells (HSCs) and embryonic stem cells (ESCs) by flow cytometry. The FC cells at passage 2 were analyzed for the chondrogenic, adipogenic and osteogenic differentiation ability in vitro for 21 days. RT-PCR analyzes for collagen type 1, collagen type 2, sox9 and aggrecan.
The FC cells grew well in a monolayer culture with a spindle morphology similar to that of human BM-derived MSCs. The flow cytometry analyses showed that the FC cells were positive for the expression of MSCs markers (CD29, CD44, CD58, CD90, CD105, CD166), ESCs marker (SSEA-4) but negative for CD34, CD45, CD117, a HSCs marker. The FC cells were also differentiated into the chondrogenic lineage, based on the Safranin O staining and RT-PCR analysis results. The expression of collagen type 2 was induced while that of collagen type 1 was reduced after chondrogenic differentiation for 3 weeks, when compared with those in monolayer culture. Unexpectedly, the expression of aggrecan was not induced significantly in the RT-PCR analysis. The chondrogenic differentiation potential of the FC cells was quite comparable with that of human BM MSCs. When examined with the Oil red O staining. Also the FC cells were clearly differentiated into the adipogenic lineage and by the Alizarin red staining, FC cells differentiated into the osteogenic lineage. We showed that the FC cells had high differentiation potential into the adipogenic and osteogenic lineages comparable to that of human BM MSCs. Our data suggests that the FC cells would be a useful source of cell therapy for regeneration of damaged cartilage.

국문 초록 (Abstract)

연골조직공학을 위해 다양한 곳으로부터 유래된 중간엽 줄기세포는 많은 관심을 받아 왔다. 하지만 중간엽 줄기세포는 연골세포로의 완전한 분화와 연골조직으로의 재생에 한계를 가지고 있다. 그래서 현재 많은 연구들이 성체줄기세포보다 더 높은 성장률을 가지고, 목표로 하는 조직으로 분화시키는데 효율적인 태아줄기세포를 조직공학을 위한 새로운 세포로 제안하고 있다. 이 연구의 목표는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포와 인간 태아 연골유래 줄기세포를 비교하여 그 특성을 분석하고자 하는데 있다.
본 연구는 태아 연골유래 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 가질 것이라는 가설아래 진행되었다. 인간 태아 연골유래 줄기세포는 아주대학교 의료원으로부터 IRB승인을 받은 후 임신 12주 된 태아로부터 분리하였다. 이 세포는 계대배양 0번째부터 6번째까지 단층배양 하면서 유세포 분석법을 통해 인간 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 배아줄기세포 표지자를 분석하였다. 태아 연골유래 줄기세포는 계대배양 2번째에서 21일간 배양하면서 연골세포분화, 지방세포분화, 골세포 분화능력을 가지는 확인 하였고 RT-PCR을 통해 collagen type Ⅰ, collagen type Ⅱ, sox9 와 aggrecan 의 발현정도를 확인하였다. 태아 연골유래 줄기세포는 단층배양에서 골수유래 중간엽 줄기세포와 비슷한 모양으로 성장하였고, 유세포 분석을 통해 표지자 확인 결과 조혈줄기세포 표지자 (CD34, CD45, CD117)에서는 발현하지 않았지만 중간엽 줄기세포의 표지자 (CD29, CD44, CD58, CD90, CD105, CD166)와 배아줄기세포의 표지자 (SSEA-4)에서는 높은 발현양상을 보였다. RT-PCR 분석을 통해서 연골세포에서 발현되는 유전자가 태아 연골유래 줄기세포에서도 발현되는 것을 관찰하였다. 태아 연골유래 줄기세포를 연골세포로 분화를 유도 시킨 후 Safranin O staining을 통해 전체적으로 GAG가 발현된 것을 확인하였다. 3주동안 연골세포분화를 유도한 후 collagen type Ⅰ의 발현이 감소하는 동안 collagen type Ⅱ의 발현이 증가한 것을 관찰하였다. 이러한 연골세포로의 분화 능력은 골수 유래 중간엽 줄기세포와 확연한 차이를 보였다. 또한 Oil red O staining을 통해 지방세포분화능력을 확인하고 Alizarin red staining을 통해 골세포분화능력을 확인한 결과 태아 연골유래 줄기세포는 이러한 계통으로도 분화되는 것을 관찰할 수 있었다. 본 연구를 통하여 태아 연골유래 줄기세포는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 가질 뿐만 아니라 연골세포로의 분화능력에 있어서는 완전한 차이를 보였고 지방세포와 골세포의 분화능력에 있어서는 보다 더 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 연구의 결과들은 인간 태아 연골유래 줄기세포는 손상된 연골이 재생을 위한 세포 치료에 있어서 유용한 세포로 사용될 수 있음을 보여준다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract = 1
• Table of contents = 3
• List of figures = 5
• List of table = 6
• I. Introduction = 7
• II. Materials & methods = 9
• 1. Isolation and culture of Human Fetal Cartilage - Derived Stem Cells (FC cells)and Human bone marrow derived stem cells (BM-MSCs) = 9
• 2. Colony-forming unit-fibroblasts (CFU-Fs) assay = 10
• 3. Cell morphology and Proliferation analysis = 10
• 4. Flow cytometry analysis of FC cells and BM-MSCs = 10
• 5. Differentiation of FC cells and BM-MSCs = 11
• Chondrogenesis = 11
• Adipogenesis = 11
• Osteogenesis = 12
• 6. Histology and immunohistochemistry = 14
• 7. Reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis = 14
• Ⅲ. Result = 16
• 1. Histology of Fetal cartilage = 16
• 2. Colony-forming unit-fibroblasts (CFU-Fs) assay = 20
• 3. Growth rate and Morphology of FC cells and BM-MSCs = 22
• 4. Flow cytometry analysis of FC cells and BM-MSCs = 25
• 5. Reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis = 27
• 6. Differentiation of FC cells and BM-MSCs = 29
• Chondrogenic differentiation = 29
• Adipogenic differentiation = 29
• Osteogenic differentiation = 30
• IV. Discussion = 34
• V. Conclusion = 38
• Reference = 39
• 국문요약 = 43