김치 분리 젖산균 활용 대장염 개선 프로바이오틱스 개발 = Development of probiotics using lactic acid bacteria isolates from Kimchi to improve colitis

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Probiotics is a living microorganism that is beneficial to the host when ingested in sufficient quantities and has recently received attention as a substitute for synthetic drugs. In particular, there are a number of studies showing that probiotics isolated from vegetable foods such as kimchi and pickled vegetables have excellent physiological activity. In this study, we investigated the anti-inflammatory function of lactic acid bacteria isolated from kimchi, a traditional Korean fermented food, as probiotics. Previous studies have shown that the three best lactic acid bacteria Lactobacillus sakei SMFM2017_NK_1, Lactobacillus fermentum SMFM2017_NK_2, Lactobacillus sakei SMFM2017_NK_3 were selected as the final best in kimchi. They have excellent acid tolerance and bile tolerance, safety (hemolysis), intestinal adhesion and has anti-oxidant ability and anti-inflammatory effect. In this study, three Lactobacillus strains selected as final candidates for probiotics were investigated in vivo to determine whether they could be developed as a useful functional food ingredient for anti-inflammation. Through in vivo experiments, DSS induced inflammation in the colon of C57BL/6N mice, and the anti-inflammatory effect of lactic acid bacteria was confirmed by oral administration of three excellent lactic acid bacteria and Lactobacillus rhamnosus GG(LGG) as a control group. In order to confirm the effect of lactic acid bacteria on the anti-inflammatory function in inflammation-induced colon, we measured the degree of inflammation by judging the change of weight and feces during 4 weeks of oral administration. After sacrifice, serum and organs were separated, and the degree of anti-oxidation was measured by the NO assay using serum to examine the direct relationship between inflammation. The mRNA was extracted from the isolated colon and cDNA was synthesized. and cytokine and anti-oxidant enzyme related to inflammation was measured through qPCR experiment for analysing the role of lactic acid bacteria on the anti-inflammatory effect. Through In vivo experiments, the strain L. fermentum SMFM2017_NK_2 was considered to be the best isolate. Its biochemical characteristics, morphological characteristics, and antibiotic resistance were evaluated. To use this strain as a probiotics, we conducted the one of the safety tests to evaluate safety is the evaluation of cytotoxicity. and we conducted thermal stability evaluation to evaluate survival about the heat generated during processing probiotics. Based on these results, we confirmed that L. fermentum SMFM2017_NK_2 strain is likely to be anti-inflammatory probiotics, and it will be developed as useful functional probiotics through additional anti-inflammatory functional experiments and further studies such as anti-cholesterol and anti-allergic.

국문 초록 (Abstract)

프로바이오틱스는 충분한 양을 섭취하였을 때 숙주에게 유익한 기능을 하는 살아있는 미생물이며, 최근 합성 의약품의 대체재로 주목받고 있다. 특히 김치나 채소 절임 등의 식물성 식품에서 분리한 프로바이오틱스가 우수한 생리활성기능을 한다는 다수의 연구 결과가 있다. 본 연구에서는 한국의 전통 발효식품인 김치에서 분리된 젖산균으로부터 프로바이오틱스로써의 항염증 기능성을 살펴보고자 하였다. 선행 연구에서 프로바이오틱스 최종 후보로 선발된 Lactobacillus sakei SMFM2017_NK_1, Lactobacillus fermentum SMFM2017_NK_2, Lactobacillus sakei SMFM2017_NK_3을 이용하여 in vivo 실험을 통해 C57BL/6N 마우스에 DSS로 염증을 유도하고 이 우수 젖산균 3개와 대표적인 프로바이오틱스 및 항염증효과로 알려진 Lactobacillus rhamnosus GG(LGG)를 경구 투여함으로써 김치분리젖산균의 항염증 효과에 대해 확인하였다. 경구 투여하는 4주 동안 무게변화와 분변의 변화를 관찰하여 염증의 정도를 판단하였고, 혈청 NO assay를 통해 항산화 정도를 측정하였으며, 분리한 대장에서 qPCR 실험을 통해 염증과 관련된 사이토카인 및 항산화효소와 관련된 유전자의 발현량을 비교하여 항염증효과에 대한 젖산균의 기능을 분석하였다. 추가적으로 생화학적 특성, 형태학적 특성, 항생제 내성을 평가하였으며, 프로바이오틱스로 이용하였을 때 안전성실험 중 하나인 세포독성평가와 프로바이오틱스로 가공 시 발생하는 열에서의 생존력을 확인하는 열안정성평가를 시행함으로써 우수한 항염증 기능성을 가지는 균주의 프로바이오틱스로써의 가능성을 확인하였다. In vivo 실험에서 DSS 투여 후 최저 무게와 젖산균 투여 후 최대 무게의 차이를 비교해 보았을 때, L. fermentum SMFM2017_NK_2를 투여한 군이 8.91%로 가장 높은 무게 증가율을 보였다. 설사와 혈변의 정도를 판단하여 질환 활성 지표 측정을 하였을 때, L. fermentum SMFM2017_NK_2를 투여한 군과 L. sakei SMFM2017_NK_3 투여군, LGG 투여군이 DSS만을 투여한 대조군과 L. sakei SMFM2017_NK_1투여군에 비해 염증 유발이 느렸으며, 염증이 유발된 후 경구 투여 마지막 날 수치를 비교했을 때에도 낮은 염증 수치를 나타내었다. 염증의 영향이 미치는 대장 및 소장의 길이에서도 L. fermentum SMFM2017_NK_2 투여군의 길이가 길었으며, 대장의 병리학적 분석에서도 L. fermentum SMFM2017_NK_2 투여군에서 염증이 완화된 결과로 항염증 효과를 확인할 수 있었다. 대장에서 염증 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6, IFN-γ, INOS, COX-2) 및 항산화 효소(SOD, GPx, CAT)의 발현량을 비교한 결과, L. fermentum SMFM2017_NK_2투여군에서의 발현량이 LGG투여군과 비슷하거나 우수한 결과를 보였고 혈청에서의 NO assay를 통해 NO 생성량 측정 결과, 3개의 젖산균 투여군과 LGG투여군이 DSS만을 투여한 대조군보다 NO생성량 수치가 낮아 젖산균의 항염증효과를 확인하였다. 추가적으로 API 생화학적특성 실험에서 김치 분리 젖산균 및 LGG의 25개의 공통적인 당 발효와 유당 대사능을 확인하였고 Catalase 및 Oxidase 실험에서도 혐기균의 특징인 음성결과를 확인하였으며, 주사전자현미경을 통해 간균임을 확인하였다. 세포독성실험인 MTT assay 결과에서는 가장 농도가 높은 8 Log CFU/mL로 젖산균을 처리한 결과에서 L. fermentum SMFM2017_NK_2와 L. sakei SMFM2017_NK_3의 세포생존율이 높았고, 열안정성실험에서는 김치 분리 젖산균 중 L. fermentum SMFM2017_NK_2이 열에서 가장 안정한 것으로 나타났다. 따라서 In vivo 실험 및 프로바이오틱스 개발을 위한 특성 실험의 결과를 바탕으로 L. fermentum SMFM2017_NK_2을 우수한 균주로 판단하였다. 추후 추가적인 항염증 확인 실험 및 프로바이오틱스의 다른 추가적인 기능성인 항콜레스테롤, 항알레르기 등과 같은 연구를 통하여 더욱 유용한 기능성 프로바이오틱스로 개발될 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 문헌고찰 = 3
• 1. 젖산균 = 3
• 1) 정의 및 일반적 특징 = 3
• 2) 기능성 = 3
• 3) 김치 젖산균 = 4
• 2. 프로바이오틱스 = 5
• 1) 정의 = 5
• 2) 시장현황 = 7
• 3) 국내 및 국제 관리 동향 = 9
• 4) 기능성 = 10
• 가)항산화 = 10
• 나)항염증 = 11
• 5) 프로바이오틱스의 조건 = 12
• Ⅲ. 재료 및 방법 = 15
• 1. In vivo 항염증 효과 = 15
• 1) 프로바이오틱스 균주 = 15
• 2) 시료 준비 및 관리 = 15
• 3) 동물 실험 디자인 및 DSS 염증 유도와 시료 투여 = 16
• 가) 실험동물 및 사육조건 = 16
• 나) 대장염 유발 및 실험식이 = 16
• 4) 체중 = 17
• 5) 질환 활성 지표 = 17
• 6) 혈청 및 장기분리 = 20
• 7) 대장 조직의 병리학적 분석 = 20
• 8) 대장 내 염증 관련 유전자 발현 분석 = 22
• 가) mRNA 추출 = 22
• 나) cDNA 합성 = 23
• 다) qRT-PCR = 23
• 9) 혈청 항염 활성 = 28
• 2. 프로바이오틱스 특성 = 28
• 1) 생화학적 특성 = 28
• 가) 당 대사능 = 28
• 나) Catalase = 29
• 다) Oxidase = 29
• 2) 항생제 내성 = 29
• 3) 형태학적 특성 = 30
• 가) 시료 접종 및 배양 = 30
• 나) FE-SEM 전처리 및 측정 = 30
• 4) 안전성 = 31
• 5) 열 안정성 = 32
• 3. 통계학적 분석 = 32
• Ⅳ. 결과 및 고찰 = 33
• 1. In vivo 항염증 효과 = 33
• 1) 체중 = 33
• 2) 질환 활성 지표 = 36
• 3) 장기 분리 = 38
• 4) 대장 조직의 병리학적 분석 = 40
• 5) 대장 내 염증 관련 유전자 발현 분석 = 43
• 6) 혈청 항염 활성 = 54
• 2. 프로바이오틱스 특성 = 56
• 1) 생화학적 특성 = 56
• 2) 항생제 내성 = 61
• 3) 형태학적 특성 = 65
• 4) 안전성 = 67
• 5) 열 안정성 = 69
• Ⅴ. 요약 및 결론 = 72
• Ⅵ. 참고문헌 = 75
• APPENDIX = 85
• ABSTRACT = 87