(The) roles of vibrio vulnificus and its virulence factor RtxA in dendritic cell-mediated Th17 responses

국문 초록 (Abstract)

비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)는 그람 음성균으로, 오염된 해산물이나 벌어진 상처를 통해 호스트의 체내로 침입, 위장염부터 패혈증까지 유발하는 위험한 균이다. 비브리오균에 감염되었을 때, 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC)인 수지상세포(Dendritic Cell, DC)에 의해 주로 매개되는 염증성 반응 관련된 여러 가지 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 생성이 촉진된다고 알려져 있다. 이를 통해 다양한 T 도움 세포 반응이 유도되는데, 그 중에서도 T 도움 17 세포의 경우, 세포의 반응이 비정상적으로 과하게 일어나면 조직이 손상되어 병원균의 침투를 야기하는 반면, 적정 수준의 반응은 감염에 대한 호스트의 방어 체계에 관여한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 비브리오균 불니피쿠스 균의 감염이 수지상세포의 성숙(maturation)과 활성(activation)을 통해 T 도움 17 세포로의 분극화를 유도하는지와 그 과정에 비브리오 불니피쿠스 균의 독성인자가 관여하는지에 관해 알아보고자 하였다.
첫째, 수지상세포는 비브리오 불니피쿠스 균에 감염되어 CD40, CD80등의 공동자극분자(co-stimulatory molecule)와 MHC Ⅱ의 발현이 증가하여 성숙과 활성화되었다. RT-PCR과 ELISA를 통해, T 도움 17 세포로 분화시키는 interleukin-1β (IL-1β)와 interleukin-6 (IL-6) 역시 mRNA와 단백질 수준에서 증가하였다. 더불어, 비브리오 불니피쿠스 균에 노출된 수지상세포를 림프노드에서 분리한 naïve T 세포와 공배양하였을 때 T 도움 17 세포군이 증가하였고, 이는 IL-6의 중화 항체 처리에 의해 다시 감소하였다. 추가로 비브리오 불니피쿠스 균에 노출된 수지상세포를 마우스 체내로 주입하였을 때에도 마우스의 림프노드 내 T 도움 17 세포군은 증가하였다. 마지막으로, 비브리오균을 경구 투여한 후 장내 대부분의 면역 세포가 존재하는 점막 고유층의 면역세포군을 분석하여 생체 내에서도 T 도움 17 세포군이 증가함을 확인하였다. 위의 결과들은 비브리오 불니피쿠스 균이 수지상세포를 통해 T 도움 17 세포 반응을 유도하고, 이는 면역병리학적 효과와 관련이 있을 것이라는 것을 보여준다.
둘째, T 도움 17 세포는 호스트의 방어 기작과 병리학적 염증 반응을 매개하는 전염증성 T 도움 세포의 한 종류이다. 우리는 이전의 연구에서 호스트의 수지상 세포가 비브리오 불니피쿠스 균에 노출되었을 때 IL-1β와 IL-6와 같은 여러 사이토카인의 생성을 통해 T 도움 17 세포 반응을 유도한다고 보고하였다. 비브리오 불니피쿠스 균은 성공적인 병리생리학을 결정짓는 주요 독성인자인 RTX 독소 (RtxA)를 생성하는데, 본 연구에선 비브리오 불니피쿠스가 수지상세포의 성숙과 활성화를 통해 T 도움 17 세포반응을 유도하는 과정에서 RtxA가 관여하는지에 관해 알아보았다. 비브리오 불니피쿠스 야생형 (WT)에 의해 증가하였던 수지상세포의 표면 표지자인 CD40의 발현은 rtxA 유전자에 돌연변이가 발생한 비브리오 불니피쿠스 균이 감염되었을 때 감소하였고, T 도움 17 세포 분화와 관련된 사이토카인의 mRNA와 단백질 생성 수준 역시 rtxA 유전자 돌연변이체에 의해 감소하였다. 야생형과 rtxA 유전자 돌연변이체 비브리오 불니피쿠스 균에 노출된 수지상세포를 순수 CD4 T 세포와 공배양한 경우에서도 역시 T 도움 17 세포 반응은 돌연변이체에서 감소하였다. 이는 비브리오균을 경구 투여한 후 장내 대부분의 면역 세포가 존재하는 점막 고유층의 면역세포군을 분석한 결과에서도 마찬가지였다. rtxA 유전자의 돌변연이로 인해 감소한 수지상세포의 성숙 정도와 T 도움 17 세포 분화 관련 사이토카인의 발현, T 도움 17 세포의 반응 등은 rtxA 유전자 복귀 돌연변이체(revertant)에 의해 다시 회복되었다. rtxA 유전자의 상위 조절자인 hlyU 유전자의 돌연변이체로 실험하였을 때 역시 rtxA 유전자 돌연변이체와 같은 결과를 얻었다.
따라서, 본 연구에서 비브리오 불니피쿠스 균은 RtxA 독소를 통해 T 도움 17 세포 반응을 유도하고, 이는 비브리오 불니피쿠스 균에 대한 호스트의 적응 면역 반응(adaptive immune response)과 연관이 있다는 것을 처음으로 규명하였다. 위의 연구는 비브리오 불니피쿠스 균의 RtxA 독소를 이용한 비브리오 불니피쿠스에 의한 질병의 예방과 치료 목적의 약물의 개발에 도움이 될 것으로 생각된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Vibrio vulnificus (V. vulnificus) is a halophilic, gram-negative bacterium, which causes life-threatening septicemia and gastroenteritis through the consumption of contaminated seafood or wound infection. In addition, V. vulnificus infection is known to stimulate the production of several pro-inflammatory cytokines, which are associated with inflammatory responses mediated predominantly by dendritic cells (DCs), functioning as antigen-presenting cells.
Here, I investigated whether V. vulnificus infection induced the maturation and activation of murine DCs, which have the ability to polarize T helper (Th) cells into Th17 cells. Dysregulated Th17 cell responses are known to cause tissue damage, promoting the penetration of pathogens; however, Th17 cells are also involved in host defense against infection. Infection with V. vulnificus significantly increased the expression of cell surface molecules, including CD40, CD80 and major histocompatibility complex class II, leading to the maturation and activation of DCs. In the present study, the analysis of the cytokine profiles of DCs upon infection with V. vulnificus revealed the preferential production of interleukin-1β (IL-1β) and IL-6, through which V. vulnificus-infected DCs induced the polarization of Th17 cells when naïve CD4+ T cells were co-incubated. The reduction of Th17 cell generation through the use of anti-IL-6 neutralizing antibodies indicated that the Th17-polarizing capacity of V. vulnificus was predominantly dependent on DC-derived IL-6. The in vivo administration of V. vulnificus-infected DCs consistently increased the Th17 cell population in the lymph nodes of mice. Finally, the oral administration of V. vulnificus in mice also increased Th17 cell responses in the lamina propria of the small intestine. These results collectively demonstrated that V. vulnificus induced inflammatory Th17 cell responses via DCs, which may be associated with the immunopathological effects caused by V. vulnificus infection.
Th17 cells are a subset of pro-inflammatory T helper cells that mediate host defense and pathological inflammation. In the previous study, I have reported that host DCs infected with V. vulnificus induce Th17 responses through the production of several pro-inflammatory cytokines, including IL-1β and IL-6. V. vulnificus produces RTX toxin (RtxA), an important virulence factor that determines successful pathophysiology. In this study, I investigated the involvement of RtxA from V. vulnificus in Th17 cell induction through the activation and maturation of DCs. The increased expression of the DC surface marker CD40 caused by V. vulnificus wild-type infection was reduced by rtxA gene mutation in V. vulnificus. The mRNA and protein levels of Th17 polarization-related cytokines also decreased in V. vulnificus rtxA mutant infected DCs. In addition, the co-culture of Th cells and DCs infected with rtxA mutant V. vulnificus resulted in reduction in DC-mediated Th17 responses. Th17 cell responses in the small intestinal lamina propria decreased in mice inoculated with V. vulnificus rtxA mutant as compared to those inoculated with the wild-type strain. These decreases in DC maturation, Th17-polarizing cytokine secretion, and Th17 responses attributed to rtxA mutation were restored following infection with the rtxA revertant strain. Furthermore, the mutation in the hlyU gene encoding the activator of rtxA1 gene reproduced the results observed with rtxA mutation. Taken together, V. vulnificus, by means of RtxA, induces inflammatory Th17 responses, which may be associated with adaptive responses of the host against V. vulnificus infection.
In conclusion, these findings indicate that V. vulnificus RtxA induces Th17 cell responses via the increased activation and maturation of BMDCs with IL-1β and IL-6 production, Th17-polarizing cytokines, in vitro and in vivo. Therefore, I revealed the novel virulence factor of V. vulnificus that is involved in adaptive immune responses against V. vulnificus infection.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER Ⅰ Vibrio vulnificus infection induces the maturation and activation of dendritic cells with inflammatory Th17-polarizing ability 21
• ABSTRACT 22
• INDTORUDCTION 24
• MATERIALS AND METHODS 27
• RESULTS
• 1. V. vulnificus infection induced the maturation and activation of bone marrow DCs 36
• 2. V. vulnificus infection increased the production of Th1/Th17-polarizing cytokines in DCs at both mRNA and protein levels 39
• 3. V. vulnificus-infected DCs induced Th17 polarization in an in vitro co-culture system 43
• 4. V. vulnificus-infected DCs induced Th17 polarization mainly through secretion of IL-6 48
• 5. V. vulnificus-infected DCs induce the polarization of Th17 cells in vivo 53
• 6. Oral administration of V. vulnificus in mice increased the population of intestinal Th17 cells 56
• DISCUSSION 60
• REFERENCES 66
• CHAPTER Ⅱ Vibrio vulnificus RtxA is a major factor driving inflammatory T helper type 17 cell responses in vitro and in vivo 72
• ABSTRACT 73
• INDTORUDCTION 75
• MATERIALS AND METHODS 78
• RESULTS
• 1. Infection with rtxA mutant strain of V. vulnificus affects the maturation and activation of DCs 91
• 2. DCs infected with rtxA mutant strain are defective in secreting Th17-polarizing cytokines 95
• 3. DCs infected with rtxA mutant strain are defective in inducing Th17 responses in vitro 98
• 4. Oral administration of V. vulnificus rtxA mutant strain in mice showed the defective induction in the population of intestinal Th17 cells 101
• 5. V. vulnificus rtxA revertant infection recovered the reduced induction of Th17 responses by rtxA mutant infection 105
• 6. Infection with V. vulnificus mutant carrying the deletion of hlyU, an activator of rtxA, resulted in consequences similar to those observed with rtxA mutant infection 109
• DISCUSSION 112
• REFERENCES 117
• FINAL CONCLUSION 126
• ABSTRACT in Korean 127