천식환자의 CSF1R 유전자의 단일염기다형성과의 연관성 : Association Analysis of colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R) Gene Polymorphisms with Asthma

국문 초록 (Abstract)

염색체 5q33-q35에 위치하는 CSF1R 유전자는 천식유발에 주요 분자이며, 염색체 5q33-q35의 유전자 marker는 여러 소수 민족내의 아토피와 천식과 연관성을 가진다고 알려져 있다. CSF1R는 target cells의 survival, proliferation과 differentiation을 포함한 다양한 세포성 반응을 유도한다. 이러한 기작은 선천성 면역에 관여하여 암과 같은 여러 질병의 발병학적으로 영향을 미친다고 알려져 있다.
우리는 대조군 303명과 천식환자 498명을 대상으로 CSF1R 유전자의 28개의 단일염기변이에 대해 상세히 조사하고, SNPs과 천식이나 아토피와 연관된 여러 요소 간의 연관성을 평가하였다. CSF1R 유전자의 mRNA와 단백질의 발현은 서로 다른 SNP Subtype을 가진 집단 간의 peripheral blood cells 내에서 real-time PCR과 Flow cytometry를 사용하여 측정하였다.
28개의 단일염기변이 중 intron에 위치한 단일염기변이(+11680G>T, +20511C>T and +28801C>G)는 천식의 위험도와 연관성이 있었다. (P=0.005, 0.001 and 0.003). Multiple comparisons 분석 결과 CSF1R +20511C>T (P=0.02) 만이 의미 있는 값을 보였고 천식 환자군에서 CSF1R +20511C>T의 T대립유전자의 빈도수는 정상대조군 보다 높았다. 열성 모델 분석 결과 천식 환자군에서 CSF1R +22693T>C의 C대립유전자의 빈도수는 정상대조군 보다 높았다. Mucosa의 염증세포와 상피세포에서 CSF1R의 발현을 확인하였으며, 대조군 보다 천식 환자군에서 CSF1R의 발현이 더 높았다. 천식환자의 peripheral blood cells로부터 분리한 Neutrophils에서 CSF1R mRNA level을 측정한 결과 +22693 T 대립유전자를 가질 때 보다 +22693 C 대립유전자를 가질 때 CSF1R의 mRNA 발현이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한 Flow cytometry 측정하여 CSF1R의 단백질 발현 양을 비교한 결과 +20511 C 대립유전자를 가질 때 보다 +20511 T 대립유전자를 가질 때 monocytes내 CSF1R의 발현이 더 높았으며, 또한 +22693 C 대립유전자를 가질 때 보다 22693 T 대립유전자를 가질 때 Neutrophil내 CSF1R의 발현이 더 낮아지는 것을 확인 하였다.
위 자료을 통해 CSF1R +20511C>T의 T대립유전자와 CSF1R +22693T>C의 C 대립유전자는 천식의 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 제시하였으나, 천식의 발병학적으로 어떠한 role에 영향을 미치는지 아는 것이 우리에게 남은 과제이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background: The colony stimulating factor 1 receptor, formerly McDonough feline sarcoma viral (v-fms) oncogene homolog(CSF1R) gene on chromosome 5q33-q35, has known to be a key molecules contributing to development of asthma. Genetic markers on chromosome 5q33-q35 are linked to the asthma and atopy in several ethnic populations. CSF1R signaling leads to a variety of cellular responses including suvival, proliferation, and differentiation of target cells. It plays an important role in innate immunity,tissue development and function, and the pathogenesis of some diseases including atherosclerosis and cancer.
Methods: Through direct DNA sequencing of CSF1R gene on chromosome 5q33-q35, we identified 39 polymorphisms, and genotyped for these SNPs in 303 normal subjects and 498 asthmatics. We evaluated the association between these SNPs and various parameters related to asthma or atopy. Expression of CSF1R protein and mRNA were measured using flow-cytometry and real-time PCR in the peripheral blood cells from these subjects with different SNP subtypes.
Results: Among the twenty eight polymorphisms tested, three intronic polymorphism (+11680G>T, +20511C>T and +28801C>G) were associated with the risk of asthma (P=0.005, 0.001 and 0.003, respectively). After correcting for multiple comparisons, however, the difference remained significant only in CSF1R +20511C>T (P = 0.02). The frequencies of the T alleles at CSF1R +20511C>T in the asthmatic group was higher than those in the normal control group (36.7% vs. 49.5%, OR=1.55). In the analysis of recessive model, the frequency of the C allele at CSF1R +22693T>C in the asthmatic group was higher than that in the normal controls group (25.8% vs. 16.4%, OR = 1.99 and P = 0.0006). The difference remained significant after correcting for multiple comparisons (P = 0.01). In the mucosa inflammation cells, we found that CSF1R protein expression higher in the BA than that in NC. In the asthmatics neutrophils, CSF1R mRNA levels who having +22693 rare allele were higher than those having +22693 common allele. Using flow-cytometry, we identified that peripheral blood cells possessing +22693 C alleles and 20511 T alleles presented higher CSF1R expression than that having +22693 T alleles and +20511 C alleles.
Conclusions: These data suggest that the T alleles at CSF1R +20511C>T and the C alleles at CSF1R +22693T>C have a susceptible effect on the development of asthma, however it remained to be further evaluated to know the exact role in asthma pathogenesis.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 4
• A. Subjects 4
• B. Sequence analysis of human CSF1R 5
• C. SNP selection and genotyping 5
• D. Tissue procession and immunohistochemistry 6
• E. RNA extraction, real-time PCR quantification for CSF1R 6
• F. Prediction of RNA secondary structure 7
• G. Measurement of CSF1R protein expression on peripheral blood cells of asthmatics 8
• H. Statistical analysis 8
• Ⅲ. RESULT 10
• A. Characterstics of study subject 10
• B. Association of SNPs in CSF1R with the risk of asthma 10
• C. The Identification of CSF1R expression between BA and NC in the airways 11
• D. Comparison of CSF1R mRNA levels from its SNP subtypes 12
• E. The prediction of RNA secondary structure according to SNP subtypes 12
• F. Flow cytometric analysis for CSF1R protein expression on peripheral blood from asthmatics 13
• Ⅳ. DISCUSSION 14
• REFERENCES 18
• TABLE AND FIGURES 21
• 국문요지 41