Caenorhabditis elegans Fanconi anemia D2 유사체의 유전체 안정성과 endocytosis에서의 기능 연구 = (The) Fanconi anemia D2 homologue in C. elegans is required for genome stability and endocytosis

국문 초록 (Abstract)

Fanconi anemia (FA)는 autosomal recessive cancer susceptibility syndrome으로서 다양한 선천성 이상과 진행성 골수기능 부진의 특징을 갖는다. FA proteins은 11 개의 독특한 complementation groups (A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J와 L)으로 구성된다. Multisubunit nuclear complex에서 모인 여섯 개의 FA proteins (A, C, E, F, G와 L) complex는 downstream인 FANCD2 protein의 activation (monoubiquitination)에 필요하다. 본 연구에서는 11 개의 FA proteins중 Caenorhabditis elegans에서 유일하게 conserved되어 있는 FANCD2 homologue (fcd-2)의 기능에 대해서 알아보기 위해 면역염색반응과 fcd-2 gene expression을 통한 RNA-mediated interference (RNAi)를 이용하였다. fcd-2-depleted animals는 coelomocyte의 기능 이상에 의한 endocytosis defect와 그로 인하여 pseudocoelomic cavity에서의 yolk protein accumulation 현상을 보인다. 그 외에도 DTC migration-defective와 bag of worms phenotype을 나타낸다. ced-1::gfp mutant strain을 사용하여 germ line에서 programmed cell death가 증가하는 것을 관찰하였는데, 이것은 human FANCD2가 불필요한 apoptosis를 막는 기능을 하는 것에 상응하는 결과이다. FANCD2 homologue (fcd-2)에 대한 항체를 이용하여 면역 염색 반응을 관찰, FCD-2가 germ cell과 oocyte, sperm, 그리고 embryonic cell의 핵 주위의 cytosol에서 발현되는 것을 관찰하였다. UV를 사용하여 DNA damage를 준 뒤, 시간 경과 별로 anti-phosphohistone H3 immunostaining하여 mitotic phase의 cell 수를 counting하였다. fcd-2(RNAi) strain의 mitosis phase cell 수는 항상 wild type에 비하여 많았으나, UV가 가해진 6 시간 뒤에는 갑자기 감소하였다가 다시 회복되었는데, 이 현상은 FCD-2 protein의 G2 checkpoint 기능을 제시하였다. 그리고 hydroxyurea를 처리하여 DNA replication을 inhibition 시키면 S phase에서 멈추지 않고,. fcd-2(RNAi) strain에서는 비정상적으로 mitotic phase로 넘어가는데, 이러한 빈도는 p53(cep-1) mutant에서 더 증가하였다. 이것은 P53와 FCD-2 protein이 S phase에서 cooperation 한다는 것을 뜻한다. fcd-2-depleted animals은 wild type에 비해 증가된 apoptotic cell 수를 나타내는데, 이 apoptosis의 증가는 p53-dependent 하였다. 결론적으로 Caenorhabditis elegans Fanconi anemia D2는 endocytosis와 SG2 phase checkpoint에서 작용하며, 그 결손은 p53-dependent apoptosis를 일으킨다.Fanconi anemia (FA) is an autosomal recessive cancer susceptibility syndrome characterized by multiple congenital anomalies and progressive bone marrow failure. FA proteins are composed of 11 distinct complementation groups (A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J and L). Six of the FA proteins (A, C, E, F and L) assembled in a multisubunit nuclear complex are required for the activation (monoubiquitination) of the downstream FANCD2 protein. In this study, to investigate the role of a FANCD2 homologue in Caenorhabditis elegans (fcd-2), which is the only one protein conserved in C. elegans among the 11 FA proteins, we performed immunostaining and fcd-2 RNA-mediated interference. fcd-2-depleted animals manifested defective yolk protein uptake by coelomocytes, which implies impaired endocytosis. In addition, fcd-2(RNAi) worms showed phenotypes of DTC-migration-defects and bag of worms. Using CED-1::GFP as a marker of germ cell death, we demonstrated that programmed cell death in the germ line was increased by RNAi of fcd-2 gene expression. FCD-2 was localized in the cytosol of germ cells, oocytes, sperms and embryonic cells by immunostatining.When germ cells at mitotic phase were detected by immunostaining for phosphohistone H3, the cell number in a gonad arm was increased by RNAi of fcd-2 and was abruptly decreased at 6 hr post UV-irradiation, suggesting a G2 checkpoint function of FCD-2. When DNA replication was inhibited by hydroxyurea treatment, RNAi of fcd-2 produced nuclei at mitotic phase with aberrant chromosomes and the frequency of chromosomal aberrancy was further increased in the p53(cep-1) mutant, suggesting that FANCD2 is a checkpoint protein during S phase and cooperates with p53. Furthermore, the increased apoptosis in fcd-2-depleted was dependent on p53.