Molecular characterization of oxidative stress responses in pseudomonas species

국문 초록 (Abstract)

이 논문의 주 목적은 토양 모델 세균인 슈도모나스 푸티다와 인체병원균인 슈도모나스 아루지노사 균의 산화적 스트레스 반응에 대한 기초적인 정보를 제공하는 데에 있다. 두 세균의 산화적 스트레스 반응에 대해서 알아보기 위해서 두 세균을 다양한 분자 생물학적 방법을 이용해서 탐구하였다.

슈도모나스 푸티다의 유전체에서 삼가철 환원효소는 밝혀져 있지 않았기 때문에 삼가철 환원효소에 대한 연구를 수행하였다. 슈도모나스 푸티다는 두 종류의 페레독신 환원효소 (FprA, FprB) 를 보유하고 있으며, 그들의 기능에 관해서는 지금까지 구체적으로 밝혀지지 않았다. 삼가철 환원효소는 구조적으로 페레독신 환원효소와 같은 범주에 속해 있다고 알려져 있다. 그래서 우리는 페레독신 환원효소들을 삼가철 환원효소로써의 기능을 알아보기 위해 슈도모나스 푸티다 야생종 균주와 돌연변이 균주를 이용해서 다양한 분자 생물학적 특징과 생리적인 특징에 대해 탐구하였다. 이를 위해서 가장 먼저, 삼가철 환원 효소 분석과 플라빈 환원 효소 분석을 시행하였으며, FprA 와 FprB 는 전자공여체로써 NADHP 와 NADH 를 선호하고 있다는 것을 알게 되었다. 또한 두 종류의 효소는 자연유래 삼가철 킬레이터 와 합성 삼가철 킬레이터 모두 전자를 전달할 수 있으며, 이를 위해서 FMN 을 전자 매개체로 이용한다는 것을 알 수 있었다. 특별히FprB 는 더 높은 효소 활성을 나타내었다. fprB 유전자 돌연변이 균주는 최소배지에 철을 첨가할 경우에 생장효율이 fprA 유전자 돌연변이 균주와 야생종 균주보다 낮다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 fprB 돌연변이 균주의 경우에 플라빈 환원 능력도 다른 두 균주와 달리 완전히 사라진다는 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도 FprB 의 NAD(P) 결합 위치의 구조가 대장균의 삼가철 환원효소와 닮았다는 것을 확인할 수 있었다. 이 연구는 최초로 슈도모나스 푸티다 내에서 플라빈 과 삼가철 환원효소의 기능에 대해서 밝힌 연구 결과이다. 또한 이 연구결과를 통해 FprB 가 NADH 를 이용해서 철 스트레스 상태에서 삼가철과 플라빈을 환원하는 중요한 효소로 작용한다는 것을 알 수 있었다.

슈도모나스 속 세균들의 항생제와 철 간의 관계를 이해가 위해서 두 종류의 슈도모나스 속 세균들을 항생제 처리 조건에서 어떤 반응을 하는 가에 대해서 다양한 연구기법을 통해서 알아보았다. 항생제는 기존에 자신들의 고유한 특징을 이용해서 세균들을 죽이는 것으로 알려져 있었으며, 이런 특징으로는 전사 억제, 리보좀 기능 억제, 세균 세포벽 생성 억제 등이 있다. 이 연구의 결과들은 항생제를 처리한 조건에서 철의 이용능력은 매우 중요하며, 특별히 슈도모나스 푸티다 와 슈도모나스 아루지노사 미생물에서 삼가철 환원효소는 펜턴 반응에 의해서 항생제 유도 세포 사멸을 가중시킬 수 있다는 것을 알 게 되었다. 또한 환원된 NADH 양의 조절과 철 킬레이션의 조절은 항생제의 활동에 직접적으로 영향을 미친다는 것을 알 게 되었다. 흥미롭게도 삼가철 환원효소의 돌연변이 균주는 항생제 저항성이 향상된다는 것을 확인할 수 있었고, 삼가철 환원효소를 과발현 시킬 경우에는 오히려 항생제에 의한 세포 사멸이 가중된다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 전사체 분석 결과들은 두 종류의 슈도모나스 균주에서 항생제를 처리한 조건에서 산화적 스트레스가 유발된다는 것을 확인해 주었고, 이는 삼가철 환원효소가 없는 돌연변이 균주에서는 산화적 스트레스가 발생하지 않는 것을 확인하였다. 따라서 항생제를 처리한 조건에서 세균은 철 이온의 항상성을 유지하는 것이 매우 중요하다는 것을 알 수 있었으며, 이는 항생제의 기능을 향상 시키기 위해서 철을 이용하는 것이 매우 중요한 적용점이 될 수 있다는 것을 말해주는 결과이다.

토양환경 내에서 많은 세균들은 질소의 부족 현상을 겪게 된다. 이런 환경은 질소의 불균형이 산화적 스트레스의 방어의 문제와 같은 심각한 현상을 일으키기 때문에 세균의 질소와 탄소간의 균형을 매우 중요하다. 글루코스-6-포스페이트 탈수고효소 (Zwf) 는 질소가 제한된 조건에서 NtrC 조절단백질에 의해서 유전자 발현이 억제되고 있다. 흥미롭게도 ntrC 유전자의 돌연변이 균주는 생장속도는 느리지만, 슈도모나스 푸티다에서 질소가 부족한 조건에서 세균이 산화적 스트레스에 견디는 능력은 향상된다는 것을 알 수 있다. 이런 현상은 또한 유동세포분석기를 이용해서 다양한 형광 산화적 스트레스 감지 염색약을 사용해서 확인하였다. 또한 전사체 분석 결과 zwf 와 같이 ntrC 돌연변이 균주에서 몇몇의 유전자들이 산화적 스트레스의 방어에 도움을 줄 수 있다는 것을 알게 되었다. 따라서, 질소의 조건에 따라서 산화적 스트레에 관여하는 많은 유전자들이 있다는 것과 NtrC 에 의해서 감지되는 질소의 이용여부는 슈도모나스 푸티다 균주 세포의 생존에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알게 되었다.

이 논문은 실험실 수준에서 산화적 스트레스에 관여하는 많은 유전적, 생리적 특징에 관해서 연구한 논문이다. 더욱이 이를 통해 알게된 산화적 스트레스 반응에 관한 정보는 생물분해자인 슈도모나스 푸티다 균주의 분해 최적화와 인체 병원균인 슈도모나스 아루지노사 균주의 제어에 매우 중요한 기여를 할 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The main purpose of this dissertation is to provide the basic information for oxidative stress response using soil bacterium, Pseudomonas putida KT2440 and human pathogenic bacterium, Pseudomonas aeruginosa PA01. To identify oxidative stress response in both strains, studies on both strains using various molecular methods were evaluated.

The ferric reductase research was conducted, because ferric reductase is not annotated on the chromosome of P. putida. P. putida harbors two Ferredoxin-NADP+ reductases (Fpr) on its chromosome, and their functions remain largely unknown. Ferric reductase is structurally contained within the Fpr superfamily. In an effort to elucidate the function of the Fpr as a ferric reductase, we employed a variety of biochemical and physiological methods using the wild-type and the fprB gene mutant strains. In both the ferric reductase and flavin reductase assays, FprA and FprB preferentially used NADPH and NADH as electron donors, respectively. Two Fprs prefer a native ferric chelator to a synthetic ferric chelator and utilize free FMN as an electron carrier. FprB has a higher kcat/Km value for reducing the ferric complex with free FMN. The growth rate of the fprB mutant was reduced more profoundly than that of the fprA mutant, the growth rate of which is also lower than the wild-type in ferric iron-containing minimal media. Flavin reductase activity was diminished completely when the cell extracts of the fprB mutant plus NADH were utilized, but not the fprA mutant with NADPH. Interestingly, the structure of the NAD(P) region of FprB resembled the ferric reductase (Fre) of E. coli in the homology modeling. This study demonstrates, for the first time, the functions of Fprs in P. putida as flavin and ferric reductases. Furthermore, our results indicated that FprB may perform a crucial role as a NADH-dependent ferric/flavin reductase under iron stress conditions.


To understanding about relationship between antibiotics and iron in Pseudomonas species, both Pseuomonas strains were tested with various experimental methods in antibiotic-treated condition. Antibiotics can induce cell death via a variety of action modes, including the inhibition of transcription, ribosomal function, and cell wall biosynthesis. In this study, results demonstrated directly that iron availability is important to the action of antibiotics and the ferric reductases of P. putida and P. aeruginosa could accelerate antibiotic-mediated cell death by promoting the Fenton reaction. The modulation of reduced nicotinamide-adenine dinucleotide (NADH) levels and iron chelation affected the actions of antibiotics. Interestingly, the deletion of the ferric reductase gene confers more antibiotic resistance upon cells, and its overexpression accelerates antibiotic-mediated cell death. The results of transcriptome analysis showed that both Pseudomonas species induce many oxidative stress genes under antibiotic conditions, which could not be observed in ferric reductase mutants. These results indicate that iron homeostasis is crucial for bacterial cell survival under antibiotics, and should constitute a significant target for boosting the action of antibiotics.

In soil condition, many bacteria suffer nitrogen starvation. This situation makes significance of balance between nitrogen and carbon, because unbalance of nitrogen in cell generates problems about malfunction of defense of oxidative stress. The zwf, which encodes glucose-6-phosphate dehydrogenase, is repressed by NtrC under nitrogen-limited condition. Interestingly, deletion of the ntrC gene significantly reduces growth rate, but renders cells more resistant to oxidative stress, under nitrogen limited condition in P. putida. More vitality of the ntrC mutant under oxidative stress condition was also confirmed by the fluorogenic redox dye using flow cytometry. The results of transcriptome analysis demonstrated that the derepression of several oxidative stress genes along with the zwf-1 gene might confer high resistance to oxidative stress in the ntrC mutant. Here, we presented the data for the first time, showing that different sets of genes are involved in nitrogen-rich and nitrogen-limited oxidative stress conditions and NtrC-sensed nitrogen availability is one of the most important prerequisite for full cellular defense against oxidative stress in P. putida.

Here, I have investigated various genetic and physical factors-related oxidative stresses in laboratory scales. Furthermore, this information along with understanding about influence of oxidative stress response by each factors will provide clues on the optimal conditions for successful either inhibitory of P. aeruginosa or biodegradation of P. putida.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER 1. GENERAL INTRODUCTION 1
• 1.1.P. putida KT2440 and P. aeruginosa PA01 as the model microorganisms 2
• 1.2.Oxidative stress 5
• 1.3. Iron and oxidative stress 10
• 1.4. Antibiotics and oxidative stress 12
• 1.5. Objectives of the study 16
• 1.6. References 18
• CHAPTER 2. Ferredoxin-NADP+ reductase from Pseudomonas putida functions as a ferric reductase 25
• 2.1.ABSTRACT 26
• 2.2.INTRODUCTION 28
• 2.3.MATERIALS AND METHODS 32
• 2.4.RESULTS 40
• 2.5.DISCUSSION 53
• 2.6.REFERENCES 61
• CHAPTER 3. Iron homeostasis affects antibiotic-mediated cell death in Pseudomonas species 67
• 3.1.ABSTRACT 68
• 3.2.INTRODUCTION 69
• 3.3.MATERIALS AND METHODS 72
• 3.4.RESULTS 79
• 3.5.DISCUSSION 123
• 3.6.REFERENCES 129
• CHAPTER 4. NtrC-sensed nitrogen availability is important for oxidative stress defense in Pseudomonas putida KT2440 134
• 4.1.ABSTRACT 135
• 4.2.INTRODUCTION 136
• 4.3.MATERIALS AND METHODS 140
• 4.4.RESULTS AND DISCUSSION 147
• 4.5.REFERENCES 188
• CONCLUDING REMARKS 193