Molecular characterization of twining and coiling growth in plants : 식물 덩굴성과 줄기 코일링의 분자적 특성 규명

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Twining growth habit is a beneficial phenotype in many wild plants, but in mass cultivation, these crops need more of manpower and facilities than the erect growth habit. However, little is known about the molecular mechanism involved in formation of vine growth habit. Therefore, this study used mapping and genomic diversity analysis to identify genetic factors related to twining growth habit in soybean. Soybean is domesticated from its wild progenitor Glycine soja. Wild soybean has both creeping nature and vines that climb on supports, while most cultivated soybean grows erect and straight. Taking the advantages of growth habit difference between wild and cultivated soybeans, F2 populations were obtained by hybridizing wild and cultivated soybeans. To find the candidate gene, we considered the presence of vines and plant height on support system in the F2 population. QTL analysis revealed that one major region in chromosome 19. Further, the QTL region was physical mapping to a 0.65 Mb from physical position 44,925,947 to 45,581,180 on chromosome 19. The 0.65 Mb region is composed of 58 predicted genes. Among them, a gene with BTB/POZ domain is considered as major candidate for the vine growth habit by considering SNP and Indel data of wild and cultivated soybeans. On the other hand, to investigate the molecular mechanism of stem coiling in Arabidopsis, a screening was carried out from T-DNA inserted activation tagging lines. A mutant with a wavy and curly morphology, and coiling branches, named cbr1, was identified. Plasmid rescue and genomic southern blot analysis confirmed the site of T-DNA insertion in the genome. RT-PCR was performed to monitor expression levels of the genes adjacent to the T-DNA integration site and showed the activation of an E3 ubiquitin ligase gene. Database search revealed that the protein with the C3HC4 type RING domain belongs to a family of E3 ubiquitin ligases. Complementation test by overexpression and RNA interference of the gene showed that activation of the novel gene caused the cbr1 mutant phenotypes. E3 ubiquitin ligase has been reported to recognize target proteins that are needing to be ubiquinated for further degradation by the proteasome complex. Further, eight candidate target substrates for E3 ubiquitin ligase were obtained by performing a yeast two-hybrid screening. To examine whether eight candidate target proteins interact with CBR1 in vivo. Eight candidate target proteins were co-overexpressed in cbr1 mutant plants. As a result, overexpression of the three putative target genes in cbr1 mutant leads to recovery of wild type. These findings indicate that the three candidate target proteins might be the major factors influenced by CBR1 E3 ubiquitin ligase to cause the cbr1 phenotype.

국문 초록 (Abstract)

자연에서 식물의 덩굴성은 여러 이점을 가지는 표현형이다. 하지만 농업적 관점에서 보면 직립형 식물과 비교했을 때 더 많은 인력과 추가적인 시설물을 필요로 한다. 아직까지는 식물의 덩굴성 특히 줄기에서 발생되는 코일링의 형태는 분자적 수준에서 알려진 바가 거의 없다. 이를 연구하기 위하여 콩을 이용하였다. 콩의 경우 야생종에서 재배종으로 선별되어 온 것으로 알려져 있으며, 야생종의 경우 포복성을 보이며 지지대를 타고 오르는 덩굴성을 가지는 반면 재배종은 대부분 직립성을 보인다. 야생종과 재배종의 생장 형태 차이를 일으키는 유전적 요인을 찾기 위하여 야생종과 재배종을 교배하여 얻은 F2 집단에서 덩굴성을 계측하고 유전자 지도를 작성하여 후보 유전자를 선별하였다. 그 결과 19번 염색체의 44,925,947 에서 45,581,180에 해당하는 물리적 위치로 줄일 수 있었으며 58개의 유전자가 포함되었다. 58개의 유전자 중 재배종과 야생종 사이의 SNP와 Indel 데이터를 분석하여 BTB/POZ 도메인을 포함하고 있는 유전자를 주된 후보 유전자로 선별하였다. 다음으로 덩굴성과 관련된 유전자 및 메커니즘을 연구하기 위하여 모델식물인 애기장대를 이용하였다. 애기장대에서 Activation tagging screening을 이용하여 줄기에서 코일링을 보이는 특이한 돌연변이 개체를 선별하였다. 이 돌연변이의 경우 줄기에서 평균적으로 4번의 코일링을 보이며 식물체가 전체적으로 물결치는 듯한 형질을 보였다. 이 돌연변이의 경우 줄기 코일링이 특이하기 때문에 cbr1 (coiled branches) 으로 명명하였다. CaMV 35S 증폭자에 의하여 영향을 받은 유전자를 확인 해본 결과 C3HC4 도메인을 갖는 새로운 E3 ubiquitin ligase를 암호화 하는 유전자 (At4g20160)가 영향을 받은 것으로 확인되었다. At4g20160 유전자가 cbr1 돌연변이 형질에 관여하는지 확인하기 위하여 Recapitulation test와 RNA interference 실험을 진행해본 결과 At4g20160 유전자의 과발현이 cbr1 돌연변이 형질을 유도하였음을 확인하였다. 유비퀴틴의 경우 전사 후 조절 인자로 식물의 생장, 유지, 번식 등 거의 모든 과정에 관여한다고 알려져 있으며 특히 E3 유비퀴틴 라이게이스의 경우 기질로 하는 단백질에 유비퀴틴을 부착하여 그 단백질의 수명을 조절하는 것으로 알려져 있다. 기질이 되는 단백질을 찾기 위하여 Yeast two hybrid system을 통하여 선별하였다. 최종적으로 8개의 후보 기질 단백질을 선별할 수 있었다. 후보 기질단백질과 CBR1 단백질의 상호작용 여부를 알아보기위하여 8개의 기질 유전자를 CBR1 유전자가 과발현되어 생성된 cbr1 돌연변이에 동시과발현 시켜보았다. 그 결과 후보 기질 8개의 동시과발현체 중 세가지에서 cbr1 돌연변이 형질이 야생형으로 회복되었다. 본 논문의 결과를 통해 애기장대 줄기에서 꼬임을 보이는 돌연변이형질이 새로운 E3 ubiquitin ligase와 그 후보 기질단백질이 관여한다는 것을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1 1
• 1.1. Introduction 2
• 1.2. Materials and Methods 5
• 1.3. Results 10
• 1.4. Discussion 21
• Chapter 2 24
• 2.1. Introduction 25
• 2.2. Materials and Methods 28
• 2.3. Results 38
• 2.4. Discussion 66
• References 72
• Abstract (in Korean) 84