Research on the Vibrio vulnificus Infectious Disease Biomarker and Development of Antibiotic-free Inhibitors Using Nanotechnology = 비리오균(Vibrio vulnificus) 감염질환 바이오마커 연구 나노화 기술을 활용한 항생제-리 제어제 개발

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Vibrio vulnificus (V. vulnificus) is an anaerobic halophilic bacterium that often induces gastrointestinal epithelial cells death, and gastroenteritis. VvhA, a hemolytic toxin, has been considered to be a major exoprotease that causes an apoptosis process affecting gastrointestinal epithelial cells. In this study, we carried out an investigation of the cellular mechanism of a 36 kDa glycoprotein isolated from RVS fruits (RVS glycoprotein) and curcumin nanosphere (CN) to improve the therapeutic potential of curcumin during the apoptosis of human intestinal epithelial cells induced by VvhA produced by V. vulnificus. The recombinant protein (r) VvhA stimulated the apoptosis by producing intracellular ROS, which was significantly inhibited by RVS glycoprotein and CN. We found that RVS glycoprotein and CN blocked phosphorylation of NF-κB, which are responsible for mitochondria-mediated apoptotic factors in a cell treated with rVvhA. In rVvhA-treated ileal-ligated mouse, CN blocked the level of intestinal apoptosis. These results indicate that RVS glycoprotein inhibits mitochondrial apoptosis stimulated by rVvhA through the blockage of ROS-mediated signaling pathway in HCT116 cells. Furthermore, CN is effective delivery system to improve the bioavailability of curcumin in the gut and has inhibitory effects on mitochondrial apoptosis induced by V. vulnificus.

국문 초록 (Abstract)

비브리오균(Vibrio vulnificus)은 혐기성의 호염균으로서 인체로 유입되어 다양한 독소를 만들어 위장관 세포 사멸 및 위장염을 유발한다고 알려져 있다. 그 중 VvhA는 위장 상피 세포에서 세포자멸사 과정을 일으키는 용혈성 독소로 알려져 있다. 현재까지 비브리오균의 감염에 대한 안전한 항생제-프리 치료법은 밝혀진 바가 적다. 본 연구는 인간의 장 상피 세포에서 VvhA에 의해 유도된 세포자멸사에 있어서 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 옻나무 과육에서 추출한 당단백질(RVS glycoprotein)과 curcumin (커큐민)의 생체이용률 한계를 향상시킨 curcumin nanosphere (CN)의 효과를 밝혔다.
장 상피 세포에서 재조합 단백질 (r) VvhA는 세포 내 ROS를 생성함으로써 세포자멸사를 촉진하였으며, 이는 RVS glycoprotein 및 CN에 의해 억제되었다. 특히, rVvhA에 감염된 세포에서 전사인자 NF-κB의 활성 억제를 통하여 세포자멸사에 관련된 인자들(Bax, Bcl-2, cleaved caspase-3)의 발현을 감소시켰다. 또한, in vivo 실험을 통해 rVvhA가 처리된 회장 결찰 마우스모델의 세포자멸사에 대한 CN의 효과를 밝혔다. 본 실험에서 CN은 rVvhA에 의해 유도된 마우스 장의 NF-κB 활성, Bax, Bcl-2, 그리고 cleaved caspase-3의 발현을 모두 정상화시켰다.
결론적으로, 본 연구에서 RVS glycoprotein이 장 상피 세포에서 ROS 생산에 매개한 신호 전달 인자의 억제를 통해 rVvhA에 의해 유도된 미토콘드리아 세포자멸사를 억제한다는 것을 알 수 있다. 또한 CN은 장에서 커큐민의 생체 이용률을 향상시킨 효과적인 전달 시스템이며 장 상피 세포에서 ROS 생산에 매개한 신호 전달 인자의 억제를 통해 rVvhA에 의해 유도된 미토콘드리아 세포자멸사에 대한 억제 효과를 갖는다는 것을 밝힌 최초의 연구이다.

목차 (Table of Contents)

• Chapter 1. Inhibitory effect of 36 kDa glycoprotein from Rhus verniciflua Stokes on apoptotic
• cell death due to Vibrio vulnificus VvhA in HCT116 cells ·············································1
• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 3
• 1. Materials 3
• 1) Chemicals 3
• 2) Cells 3
• 2. Methods 4
• 1) Cell viability assay 4
• 2) Reactive oxygen species (ROS) detection 4
• 3) Western blot analysis 4
• 4) Cell number count 5
• 5) Isolation of Rhus verniciflua Stokes (RVS) glycoprotein 5
• 6) Purification of the recombinant protein (r)VvhA 5
• 7) Statistical analysis 7
• Ⅲ. RESULTS 8
• 1. RVS glycoprotein has inhibitory effect on cell death caused by V. vulnificus 8
• 2. RVS glycoprotein attenuates ROS production to inhibit cell death promoted by rVvhA 10
• 3. RVS glycoprotein blocks PKC/MAPK pathway induced by rVvhA 13
• 4. Effect of RVS glycoprotein on phosphorylation of NF-κB induced by rVvhA 18
• 5. RVS glycoprotein regulates expression of apoptosis-related proteins induced by rVvhA 20
• Ⅳ. DISCUSSION 23
• Chapter 2. Curcumin nanosphere has an inhibitory effect on mitochondrial cell death induced
• by Vibrio vulnificus VvhA in intestinal epithelial cells 27
• Ⅰ. INTRODUCTION 27
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 29
• 1. Materials 29
• 1) Chemicals 29
• 2) Cells 29
• 2. Methods 31
• 1) Ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis) analysis 31
• 2) Field emission scanning electron microscope (FE-SEM) measurement 31
• 3) Preparation of curcumin nanosphere (CN) 31
• 4) Immunofluorescence analysis 32
• 5) Ileal-ligated mouse model 32
• 6) Apoptosis detection 33
• 7) Statistical analysis 33
• Ⅲ. RESULTS 34
• 1. Characterization of curcumin nanosphere (CN) 34
• 2. Effect of CN on ROS-mediated cell death induced by V. vulnificus 36
• 3. CN inhibits the phosphorylation of c-Src/PKC induced by rVvhA 39
• 4. Inhibitory effect of CN on JNK/NF-κB pathway activated by rVvhA 44
• 5. Inhibitory effect of CN on mitochondrial apoptosis caused by rVvhA 49
• 6. CN blocks mitochondrial apoptosis caused by rVvhA in mouse ileum 52
• Ⅳ. DISCUSSION 55
• Ⅴ. REFERENCES 59
• Ⅵ. ABSTRACT IN KOREAN 66
• Ⅶ. ABSTRACT IN ENGLISH 68