Study of antiviral activities of HCV genome replication inhibitors and their antiviral mechanism of actions = C형 간염 바이러스 RNA 게놈 복제 저해제의 항바이러스 활성 및 기전연구

국문 초록 (Abstract)

C 형 간염 바이러스 (HCV)는 만성 간염, 간경화 및 간암 등 간질환을 유발하는 임상 적으로 중요한 바이러스이다. 현재의 기본적인 HCV 치료 요법으로는 인터페론 알파와 리바비린 을 사용한다. 인터페론 알파와 리바비린의 경우 낮은 임상 효능과 심각한 부작용을 가지고 있다. 따라서 이보다 안전하고 효과적인 항 바이러스 약물을 개발하기 위해 저 분자 라이브러리 스크리닝을 통해 바이러스 게놈 복제를 억제하는 전임상 후보 화합물을 찾고 메커니즘을 확인한다. 이 연구에서 renilla luciferase-linked HCV replicon 세포를 이용하였고 WST 와 renilla luciferase 활성 실험 방법을 통해 세포 독성과 항 바이러스 효능을 분석 했다. 이 후 낮은 세포 독성과 매우 강력한 항 HCV 복제 활성을 나타내는 여러 화합물 및 천연물을 확인했다

High throughput screening 을 통해 HCV 복제 억제 제를 발견하기 위해 Renilla luciferase-linked genotype을 사용하여 6500 개의 합성 화합물과 344 개의 전통적인 아시아 식물 추출물을 스크리닝 했다. HCV 복 제 저해활성을 갖는 인돌 화합물 12 와 올리고스틸벤을 함유하는 포도근 추출물을 발견했다.

첫 번째 3개 그룹의 인돌 화합물 유도체가 합성되었고 HCV 복제 저해에 대한 효과를 확인하였다. 인돌 화합물 유도체에 대한 구조 활성 연구에서 E)-N-(4-tert-butylphenyl)-3-(5-cyano-1H-indol-3-yl)-2-methylacrylamide (12e)가 가장 낮은 세포 독성 (EC50 = 1.1 μM, EC90 = 2.1 μM 및 CC50 = 61.8 μM)을 보였고 또한 HCV RN 복제를 저해 하는 가장 강력한 억제제로 확인 하였다. 이후 유전자형 2a (J6 / JFH1) HCV RNA 와 유전자형 1b (Bart79I sub genome replicon) HCV RNA를 transfection 한 세포에서 바이러스 RNA 수준 과 단백질 저해 수준을 확인 한 결과 용량 및 시간 의존적으로 감소 시키는 것을 확인하였다. 메커니즘 연구를 위해12e에 내성을 갖는 돌연변이 바이러스의 유전자 분석 연구를 수행하였다. 12e 의 내성을 같은 돌연변이 HCV 의 유전자 분석 결과를 통해 HCV 의 NS5B RNA 중합 효소가 12e의 잠재적 표적이 될 수 있다고 확인 했다. 이 결과를 토대로 in-vitiro NS5B RNA 중합효소 활성 실험을 통해 12e가 RNA 중합효소를 억제 하는 것을 입증하였다 (IC50 = 292nM). 또한 PCR array 분석을 수행 한 결과, 12e가 CXCL-8, IL-1α, TNF-α, IL-3, IRAK-1, DDX58 등의 항 염증성 사이토카인 유전자의 전사를 활성화 한다는 것을 발견했고 12e가 HCV 복제 억제 활성을 가진 가용성 인자의 분비를 유발 할 수 있음을 발견하였다. 더 나아가, 재조합 CXCL-8 단백질을 처리한 HCV 감염 세포에서 HCV 복제를 감소시키는 것을 확인 하였다.

두 번째로344 개의 전통 아시아 식물로 구성된 에탄올 추출물 라이브러리를 이용하여 세포 기반 스크리닝을 수행했다. 스크리닝 결과 포도 덩굴 뿌리 추출물 (GRE)이 세포 독성 없으며 강력한 HCV 복제 억제 활성을 가지고 있었다. GRE를 분석한 결과 resveratrol tetramer 구조인 vitisin B가 HCV 복제를 억제 (EC50 = 6nM 및 CC50> 10μM) 하며 나노 몰 단위의 활성을 보였다. 또한, vitisin B와 NS5B polymerase inhibitor (sofosbuvir)의 병용 치료는 시너지 효과 또는 적어도 추가적인 항 바이러스 활성을 보였다. Vitisin B 는 다수의 vitisin B 내성 HCV 변이의 유전자 분석을 통해 NS3 헬리케이즈를 vitisin b의 표적으로 밝혀 냈다. DARTS assay를 통해 vitisin B와 NS3 helicase 사이의 직접적인 결합을 확인 했고 시험관 내 헬리케이즈 저해 확인 실험 에서 vitisin B 가 HCV NS3 헬리케이즈 (IC50 = 3 nM) 를 강력하게 저해 하는 것을 확인했다. 마지막으로, 임상 적으로 유효한 농도의 vitisin B 를 쥐에게 복막 주사 후 확인 한 결과 vitisin B가 간에 분포하는 것을 관찰했다.

두 가지의 HCV RNA복제의 강력한 저해제 인 12e 와 vitisin B를 발견하였고 더 나아가 HCV RNA복제 억제 메커니즘을 밝혀냈다. 12e는 NS5B RNA중합효소를 억제하고, 항 염증성 및 항 바이러스 사이토카인 유전자를 유도하여 HCV RNA를 복제를 저해 하는 것을 확인 하였다. 또한 강력한 HCV 복제 저해제인 vitisin B는 NS3 헬리케이즈 에 직접 결합하여 NS3 헬리케이즈 활성 저해를 통해 HCV RNA 복제를 억제한다. 이로써12e와 vitisin B가 가까운 장래에 새로운 HCV 치료제로 사용될 수 있기를 희망한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Hepatitis C virus (HCV) is a clinically important pathogen responsible for fatal liver diseases including chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. Although interferon alpha and ribavirin are two key components of current standard anti-HCV therapy, they have shown a suboptimal clinical efficacy and serious side effects. Therefore, in order to develop more safe and efficacious antiviral drugs, I aimed to identify preclinical candidate compounds which inhibit virus genome replication through small molecules library screening. In this study, I tested anti-HCV replication activities as well as cytotoxicities of in-house compounds and natural plants extracts by using a renilla luciferase-linked HCV replicon and a WST-based cell viability assay. I identified several compounds which exhibited a highly potent anti-HCV replication activity with a minimal cytotoxicity.

In order to identify the inhibitors of HCV replication with a novel scaffold via a mechanistically unbiased approach, I screened our in-house library composed of 6500 synthesized compounds and 344 traditional Asian herbal plants extracts with various chemical structures by using the renilla luciferase-linked genotype 2a reporter virus, and I identified a series of compounds containing either indole or oligostilbene moieties that were active against HCV replication.

First, three groups of indole derivatives were synthesized and their inhibitory effects on HCV replication were evaluated. In the present structure activity relationship study of these indole derivatives, I discovered that (E)-N-(4-tert-butylphenyl)-3-(5-cyano-1H-indol-3-yl)-2-methylacrylamide (12e) was the most potent inhibitor of HCV replication with a minimal cytotoxicity (EC50 = 1.1 μM, EC90 = 2.1 μM, and CC50 = 61.8 μM). Also I confirmed that 12e caused a dose- and time- dependent reduction of viral RNA as well as viral protein levels in both genotype 2a J6/JFH1 RNA-transfected cells and genotype 1b Bart79I sub-genomic replicon cells. I performed genetic mapping study of mutant viruses resistant to 12e. This study suggested that NS5B RNA polymerase could be a potential target for 12e. This finding was further validated by demonstration of inhibition of NS5B RNA polymerase in vitro by 12e (IC50 = 292 nM). Also I performed PCR array analyses and found that 12e was able to activate transcription of a number of pro-inflammatory as well as antiviral cytokine genes including CXCL-8, IL-1α, TNF-α, IL-3, IRAK-1, and DDX58. Their induction by 12e was verified by individual RT-PCR analyses. I found that 12e was able to stimulate secretion of soluble factors with an anti-HCV replication activity. Interestingly, a recombinant CXCL-8 protein was also able to reduce HCV replication.

Second, I performed cell-based screening of an ethanol extract library composed of 344 traditional Asian herbal plants. I found that the grapevine root extract (GRE) possessed the greatest anti-HCV replication activity with a minimal cytotoxicity. Particularly, the resveratrol tetramer, vitisin B from GRE showed single-digit nanomolar potency against HCV replication (EC50 = 6 nM and CC50> 10 μM). In addition, combined treatment of vitisin B with an NS5B polymerase inhibitor (sofosbuvir) exhibited a synergistic or at least additive antiviral activity. Analysis of a number of vitisin B-resistant HCV variants suggested an NS3 helicase as its potential target. I confirmed a direct binding between vitisin B and a purified NS3 helicase in vitro. I also found a potent inhibitory activity of vitisin B against an HCV NS3 helicase (IC50 = 3 nM) in vitro. Finally, I observed that a preferred tissue distribution of vitisin B in the liver after a peritoneal injection into rats at clinically attainable concentrations.

In conclusion, I discovered 12e and vitisin B, potent inhibitors of HCV replication and identified a mechanism of HCV replication. 12e inhibit NS5B polymerase, and induction of pro-inflammatory genes as well as antiviral cytokine genes. Also vitisin B was directly binding NS3 helicase and inhibit HCV replication through inhibition of NS3 helicase activity. I hope that 12e and vitisin B could be further developed in the near future to serve as a new class of anti-HCV therapeutics with a novel mode of action.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 9
• Materials and Methods 22
• Chemical genetics-based discovery of indole derivatives as HCV inhibitors and their inhibition of HCV replication through modulation of HCV NS5B polymerase and pro-inflammatory cytokines 41
• Identification of a resveratrol tetramer as a potent hepatitis C virus helicase Inhibitor 100
• Summary 154
• Abstract in Korean 156
• References 160