Mechanism controlling spontaneous activity in kӧlliker's organ of developing mammalian cochlea = 발달중인 포유류 달팽이관 콜리커 기관의 자발성 활동을 조절하는 기전

국문 초록 (Abstract)

발생중인 달팽이관의 내이 유모세포는 온 청각 기관에 전달되는 자발성 전기 활동을 나타낸다. 경험에 의하지 않은 자발적 신경 활동은 신경의 생존, 성숙, 발달 그리고 정보를 외부에서 발생중인 달팽이관의 내이 유모세포는 온 청각 기관에 전달되는 자발성 전기 활동을 나타낸다..청각이 시작 되기 전 컬리커 기관의 지지세포는 간극연접의 헤미채널을 통해 ATP를 내보내면서 특이한 자발성 전기 활동을 나타낸다. ATP는 주위 지지세포의 퓨린 수용체를 활성화 시켜 세포내 Ca2+을 증가시키고, 지지세포의 부피를 극적으로 증가 시킨다. 지지세포의 부피 변화를 일으키는 분자는 아직 확실시 되지 않고 있다. 자발성 활동에 의한 세포 부피 변하는 Ca2+의존적 Cl- 전류에 의한 것으로 제안되고 있다.면역조직화학 결과 Ca2+의존적 Cl- 통로인 TMEM16A가 달팽이관의 콜리커 기관에 발현하고 있었다. 칼레티닌과 동시 면역 염색 결과 TMEM16A는 내부 지지세포 (ISC) 에 위치하였다. ISC의 Ca2+의존적 Cl- 전류에 TMEM16A가 관여하는지 알아보기 위해 전기생리학적 (sEP) 그리고 광학적 (sOC) 으로 자발성 활동을 모니터 하면서 TMEM16A 저해제와 타켓 shRNA를 처리하였다. 선택적 TMEM16A 저해제인 MONNA는 sEP 와 sOC 를 모두 억제시켰다. 비슷하게 TMEM16A가 TMEM16A-shRNA에 의해 억제됐을 때도 sEP 와 sOC 를 모두 억제됐다. 이 결과는 TMEM16A에 의한 Ca2+의존적 Cl- 전류가 ISC 의 자발성 활동의 주요한 부분을 차지할 것임을 제시한다.

세포막을 통한 Cl-의 움직임은 삼투압에 의한 물 움직임에 의한 것으로 잘 알려져 있고 이것에 의해 세포 부피가 변한다. 그러나 ISC 세포 부피 변화와 관련된 자발성 활동은 특이하게 빠르기에 물 통로가 이 과정에 관여할 것이라고 제시된다. 그러므로 ISC 의 아쿠아포린 발현을 살펴보았다. 면역염색결과 AQP4가 태어나서부터 어른이 될 때까지 ISC에 발현하고 있었다. AQP4가 ISC에서 Cl-유입에 의한 물의 움직임에 관여하는지 보기 위해 아세타졸아미드와 AQP4-shRNA가 있는 상황에서 sEP와 sOC를 측정하였다. 아세타졸아미드와 AQP4-shRNA 둘 다 sOC 는 억제하였지만 sEP는 변화가 없었다. 이 결과는 AQP4가 Cl-유입에 의한 물의 움직임에 관여하나 직접적인 이온 움직임에는 관여하지 않는다는 것을 제시한다.

Cl-와 물 유출에 의한 세포 수축 후, ISC 는 원래 세포 부피로 복구 됐고 이것은 Cl-와 물이 ISC 로 다시 채워졌음을 의미한다. 많은 분비세포에서 Na+K+2Cl-동시수송체인 NKCC는 Cl-와 물을 세포에 다시 채워 넣는데 기여한다. 그러므로 우리는 ISC 에서 NKCC를 살펴보았다. NKCC 저해제인 뷰메타나이드는 sEP 와 sOC를 모두 억제시켰다. 다음으로 발생학적 과정에서 NKCC1의 발현을 살펴보았다. NKCC1이 자발성 활동을 조절하는지 알아보기 위해 NKCC1-shRNA를 배양된 달팽이관에 처리하였고 NKCC1-shRNA는 sEP와 sOC 모두 억제 시켰다. 우리는 몇 개의 분자적 타킷 TMEM16A, AQP4 그리고 NKCC1을 청각 발생시 생기는 자발성 활동을 조절하는 대표 조절자로 찾았다. 이러한 결과는 청각 회로 발생시 생기는 자발성 활동의 기능적 역할을 연구하는데 있어 분자적 타깃을 제공할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Inner hair cells (IHCs) in the developing cochlea exhibit spontaneous electrical activity that propagates throughout the auditory centers of the brain. Experience independent neural activity has been widely implicated in promoting neuronal survival, maturation, growth, and refinement of their connections to form a network that can process the information from the external world and adapt to the environment. Previous studies have indicated that this activity is initiated by the release of adenosine triphosphate (ATP) from inner supporting cells (ISCs) within the Kölliker’s organ, which lies medial to IHCs. Other studies have shown that the spontaneous activity in IHCs and the auditory nerve fiber is associated with a morphological change in ISCs.

In this thesis, we combined immunohistochemistry, cellular electrophysiology, and pharmacology to determine the molecular mechanism underlying the spontaneous morphological change of ISCs within the developing cochlea. We hypothesized that the cell volume change in ISCs was due to ATP-coupled Ca2+-activated Cl- current. Immunohistochemistry studies showed that TMEM16A, a Ca2+ activated Cl- channel, was expressed in developing cochlea. While monitoring the spontaneous activity electrophysiologically (sEP) and optically (sOC), MONNA, a selective TMEM16A blocker, and TMEM16A-shRNA inhibited both ATP dependent sEP and sOC. This indicates spontaneous activity in ISCs is mediated by TMEM16A. The release of Cl- from TMEM16A is accompanied by osmotically driven water movement, thereby causing cell shrinkage. The spontaneous activity associated with cell volume change in ISCs appeared unusually rapid, suggesting an involvement of a water channel in the process. Therefore, the expression of aquaporin (AQP) in ISCs was investigated. We found that AQP4 was expressed in ISCs of developing cochlea. Inhibition of AQP4 with acetazolamide and AQP4 shRNA markedly reduced sOC but not sEP. This result suggested that AQP4 is responsible for the water movement associated with Cl- influx but does not directly affect the ion flux. ISCs regained their cell volume soon after the cell shrinkage that accompanies Cl- and water flux, suggesting that the Cl- and water are reloaded into the ISCs. In many secretory cells, NKCC (Na+ K+ 2Cl-) symporter, is responsible for reloading cellular Cl- and water. We found that NKCC1 was expressed in ISCs. Inhibition of NKCC1 with bumetanide, an NKCC blocker, and NKCC1-shRNA inhibited both morphological change and the electrical activity in ISCs.

These results indicate that epithelial-like supporting cells in the developing cochlea have adapted a pathway for morphological change in Kölliker’s organ which might influence the periodic excitation of IHC and ANF before the onset of hearing. Our work highlighted a few molecular targets, namely TMEM16A, AQP4, and NKCC1, as the key regulators of the spontaneous activity during auditory development. These results may provide a molecular target in an animal model for studying the functional roles of spontaneous activity in the developing auditory circuits.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT 1
• 1. INTRODUCTION
• 1. Mammalian hearing 3
• 1.1 Cochlea 3
• 1.2 Sensory hair cells 5
• 1.3 Cochlear innervation 7
• 1.4 Mechano-electrical transduction 9
• 1.5 Synpatic transmission 9
• 1.6 Supporting cells 11
• 1.7 Types of Supporting cells 11
• 1.7.1 Hensen’s and Claudius cell. 11
• 1.7.2 Deiters cells (outer phalangeal cell) 13
• 1.7.3 Pillar cells 14
• 1.7.4 Inner border and inner phalangeal cells 14
• 1.7.5 Kölliker’s organ 15
• 1.7.6 Functions of supporting cells 15
• 1.8. Activity in Kölliker’s organ 17
• 1.8.1 Purinergic signaling 17
• 1.8.2 Purinergic receptors in developing cochlea 18
• 1.8.3 Spontaneous activity in Kölliker’s organ 18
• 1.8.4 Ca2+ signaling in Kölliker’s organ 22
• 1.8.5 Morphological change in Kölliker’s organ 23
• 1.8.6 Possible roles of spontaneous morphological change
• in Kölliker’s organ 24
• 1.9 Rationale of study 25
• 2. OBJECTIVE 29
• 3. MATERIALS and METHODS
• 3.1. Animals 30
• 3.2 Experimental design 30
• 3.3 Immunohistochemistry 31
• 3.4 Immunoblot 33
• 3.5 Electrophysiology 33
• 3.6 Optical imaging 35
• 3.7 Organotypic culture 35
• 3.8 Statistical analysis 37
• 4. RESULTS
• 4.1 TMEM16A, a Ca2+ activated Cl- channel mediates spontaneous
• activity in ISC of developing cochlea 38
• 4.1.1 Cl- channel opening mediates spontaneous inward
• current and cell crenation 38
• 4.1.2 TMEM16A is highly expressed in ISC of a
• prehearing cochlea 39
• 4.1.3 TMEM16A is required for spontaneous activity 40
• 4.2 AQP4, a water pore channel mediates morphological change in ISC of a cochlea 56
• 4.2.1 AQP4 is highly expressed in ISC of prehearing cochlea 56
• 4.2.2 AQP4 is required for spontaneous morphological change 57
• 4.3 NKCC1 mediates spontaneous activity in developing cochlea 67
• 4.3.1 NKCC is required for spontaneous activity
• in the cochlea 67
• 4.3.2 NKCC1 is expressed in ISC of cochlea but not NKCC2 68
• 4.3.3 Downregulation of NKCC1 inhibited spontaneous activity in ISC of cultured cochlea 69
• 4.4 TMEM43, a deafness gene 83
• 4.4.1 TMEM43 is highly expressed in supporting cells of cochlea 83
• 4.4.2 TMEM43 does not contribute to spontaneous activity 85
• 4.4.3 TMEM43 mutant mice reveal morphology dysfunction
• in ISC 85
• 4.4.4 Connexin 26 (Cx26) was intact in TMEM43 mutant mice 86
• 5. DISCUSSION
• 5.1 TMEM16A and its physiological functions 101
• 5.2 AQP4 and its physiological functions 102
• 5.3 NKCC1 and its physiological function 105
• 5. CONCLUSION 109
• REFERENCES 111
• 국문초록 127
• ACKNOWLEDGEMENT 130