형질전환 소 생산 효율 향상에 대한 연구 = Study of methods for improving transgenic cow production efficiency

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Recently, the transgenic animal production technique is very important for the production of bio-parmaceutical as animal bio-reactor system. However, the absence of survival evaluation in in vitro produced transgenic embryos has been a problem of the low productivity of transgenic animal because of absent of pre-estimate of pregnancy after transgenic embryos transferred into recipient. Therefore, this study is conducted to improve efficiency of transgenic cattle production by transgenic technique. Firstly, this study is to develop transgenic cell line expressing targeted human granulocyte colony stimulating factor (hGCSF) and green fluorescence protein (GFP) genes as well as production of Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) embryos derived from co-expressed transgenic donor cells. Constructed pPiggy-mWAP-hGCSF-EF1-GFP vector was chemically transfected into bovine fetus cells and then, only GFP expressed cells were selected as donor cells for SCNT. Cleavage and blastocyst rates of parthenogenetic, SCNT embryos using non-TG cell and hGCSF-GFP dual expressed SCNT embryos were examined (cleavage rate: 78.0±2.8 vs. 73.1±3.2 vs. 70.4±4.3%, developmental rate: 27.2±3.2 vs. 21.9±3.1 vs. 17.0±2.9%). Result indicated that cleavage and blastocyst rates of TG embryos were significantly lower (P<0.05) than those of parthenogenetic and non-TG embryos, respectively. Also, transgenic bovine embryos were produced by injection of FIV-EGFP lentiviral vector into perivitelline space of in vitro matured MІІ stage oocytes, and then in vitro fertilization (IVF) was occured. Normal IVF and EGFP expressing blastocysts were transferred into recipients. Results indicated that 2 expanded blastocysts (34.7%) transferred group showed significantly (p < 0.05) higher pregnancy rate than 1 expanded blastocyst (26.8%) transferred group. In case of parity of recipient, ET to heifer (34.9%) showed significantly (p < 0.05) higher pregnancy rate than ET to multiparous recipient (21.2%). However, there are no significant differences of pregnancy rate between natural induced estrus and artificial induced estrus groups. Significantly (p < 0.05) higher pregnancy rate was obtained from recipient group which have normal corpus luteum with crown group (34.8%) than normal corpus luteum without crown (13.6%). Additionally, treatment of 100 ㎍ Gn-RH injection to recipient group (38.6%) 1 day before ET significantly (p < 0.05) increase pregnancy rate than non- Gn-RH injection to recipient group (38.6%). We also transferred 2 EGFP expressing expanded blastocysts to each 19 recipients, 7 recipients were pregnant and finally 5 EGFP transgenic cattle were produced under described ET condition. Therefore, our result suggested that transfer of 2 good-quality expanded blastocysts to 100㎍ of Gn-RH injected recipient which have normal corpus luteum with crown is feasible to produce transgenic cattle.

국문 초록 (Abstract)

본 연구는 기존의 낮은 형질전환 소 생산효율을 증진시키기 위하여 최적의 조건을 개발하고자 실시하였다. 체세포 복제기술을 이용하여 인간 과립구 집락 촉진인자 (human Granulocyte-colony stimulating factor: hGCSF)와 녹색형광 단백질 (Green Fluorescent Protein: GFP) 유전자가 동시에 발현하는 형질전환 소를 개발하고자, hGCSF와 GFP 유전자가 동시에 발현하는 체세포 복제수정란의 생산효율을 조사하였다. 이를 위하여 개발된 pPiggy-mWAP-hGCSF-EF1-GFP 벡터를 소 태아세포에 도입하였으며, 유전자 도입 후 GFP 단백질의 발현유무에 따라 외래 유전자만 도입된 세포를 선별 하였다. 이들 GFP 유전자 발현 체세포는 체외성숙된 소 난자의 핵과 치환하여 체세포 복제기술로 hGCSF-GFP가 동시에 발현하는 형질전환 난자를 생산하였다. hGCSF-GFP가 동시 발현하는 체세포 복제수정란의 배발달 효율을 일반 소 태아세포를 이용한 체세포 복제수정란과 단위발생란의 분할율 및 발달율과 비교하여 조사하였다. 그 결과, 단위발생란과 일반 체세포 복제수정란은 각각 78.0±2.8%와 73.1±3.2%의 분할율을 보였으며, 배반포까지의 발달율은 각각 27.2±3.2와 21.9±3.1%로써 일반 체세포 복제수정란이 단위발생란에 비하여 분할률과 발달율이 유의차 있게 낮았다(P<0.05). 또한, hGCSF-GFP 동시발현 소 태아세포를 이용하여 생산된 체세포 복제수정란의 분할율과 배반포율이 각각 70.4±4.3%와 17.0±2.9%로써, 일반 체세포 복제수정란에 비교하여 배반포로의 발달율이 저조하였다(P<0.05). 수란우에 이식되는 확장배반포 수에 따른 임신율을 조사한 결과에서, 임신율은 2개 주입한 것이 1개 주입한 것보다 유의적으로 높았다 (P<0.05). 수란우의 산차에 따른 임신율을 조사한 결과에 있어서는 미경산우가 경산우보다 유의하게 높았지만 (P<0.05), 자연발정과 PG 투여에 의한 발정유도에 따른 배반포란의 이식 후 임신율에 있어서는 유의적 차이가 보이지 않았다. 황체 상태에 따라 임신율을 조사하였을 경우에는 황체가 정상이고 crown이 있는 경우가 황체 크기는 정상이나 crown이 없는 것보다 유의하게 높았다 (P<0.05). 또한, 배반포 이식 시 수란우에 Gn-RH 투여 여부에 따른 임신율을 조사한 결과에 있어서는 이식전날 (발정 7일째) 100 ㎍ Gn-RH를 근육주사를 하였을 경우가 임신율이 유의하게 높았다 (P<0.05). 특히 이러한 이식조건 하에서 19두의 대리모에 각각 2개씩 EGFP 형질전환 확장배반포를 이식하였을 경우에는 7마리가 임신과 성공적으로 5마리의 EGFP 형질전환 소가 생산되었다. 따라서 이상의 결과로 수정란 이식시 수태율을 높이기 위해서는 2개의 질적으로 우수한 확장배반포를 crown이 있는 황체를 가진 미경산우에 이식전날 100㎍ Gn-RH 근육주사 후 이식하는 것이 형질전환 소 생산에 효율적이라 것으로 조사되었다.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서론 1
• 제2장 재료 및 방법 3
• 1. 소 미성숙난자의 회수 및 체외성숙 유도 3
• 2. 공여세포 준비 3
• 3. 유선조직 특이적인 bGCSF 유전자 발현을 위한 vector의 구축 3
• 4. 공여세포에 유전자 도입 4
• 5. 소 성숙난자의 체세포복제 4
• 6. 소 복제수정란의 난활성 및 체외배양 6
• 7. 형질전환 복제수정란의 RT-PCR 분석 6
• 8. Lentiviral vector 생산 6
• 9. 난자 위란강에 Lentiviral vector의 미세주입 8
• 10. 소 성숙난자 체외수정 및 배발달 8
• 11. 배반포의 수란우에 이식 8
• 12. 통계분석 9
• 제3장 결과 10
• 제1절 체세포 복제기법을 통한 형질전환 소 난자 생산 10
• 제2절 Lentivirus를 난자 위란강 주입을 통한 형질전환 소 생산 14
• 1. 수란우의 요인에 따른 임신율 조사 14
• 2. 형질전환 난자이식 및 산자생산 21
• 제4장 고찰 25
• 제1절 체세포 복제기법을 통한 형질전환 소 난자 생산 25
• 제2절 Lentivirus를 난자 위란강 주입을 통한 형질전환 소 생산 27
• 참고문헌 30
• ABSTRACT 35