Studies on the neuroprotective effects and mechanisms of Akt phosphorylation by melatonin

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Melatonin, the major secretory product of the pineal gland, has a variety of important physiological functions. It has been reported that melatonin protects neurons in culture from cell death induced by several neurotoxins. In the present study, the underlying protective mechanism of melatonin on kainic acid (KA)-induced excitotoxicity was examined in the hippocampus of mice. KA, administered intracerebroventricularly (i.c.v.), induced marked neuronal cell death with concurrent microglial activation and subsequent induction of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the hippocampus. Histopathological analysis demonstrated that melatonin (10 mg/kg), administered 1 hr prior to KA, attenuated KA-induced death of pyramidal neurons in the CA3 region. Melatonin obviously suppressed KA-induced microglial activation and consequent iNOS expression that were determined by increased immunoreactivities of microglial marker OX-6 and iNOS, respectively.
Akt, a downstream effector of PI3K, is a critical mediator of neuronal survival in pathological neuronal cell death such as excitotoxic injury. In order to determine whether Akt is activated by melatonin treatment, the level of Akt phosphorylation was examined in CA3 region of hippocampus up to 24 hr after melatonin treatment. Increased phosphorylation of Akt in pyramidal neurons was observed as early as 2 hr after administration of melatonin. After melatonin administration, Akt and cAMP response element (CRE) binding protein (CREB) were also phosphorylated in astrocyte and the expression of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) and transforming growth factor-β (TGF-β), was increased. Considering that CREB is the substrate of p-Akt, and p-CREB can increase GDNF and TGF-β expression, astrocytic Akt phosphorylation by melatonin can be one of the important mechanisms of neuroprotection.
To evaluate the pathway of astrocytic Akt phosphorylation activated by melatonin, I treated wortmannin, specific inhibitor of PI3K, and luzindole, a non-selective melatonin receptor antagonist, prior to the administration of melatonin. The results showed that wortmannin completely blocked the melatonin induced phosphorylation of Akt. In contrast, luzindole partially did it. Also GDNF and TGF-β expression by melatonin was inhibited by pretreatment of wortmannin or luzindole.
The results of the present study demonstrate that melatonin exerts its neuroprotective action against KA-induced excitotoxicity both through the activation of neuronal and astrocytic Akt, and through the direct and indirect inhibition of microglial activation. Therefore, the present study suggests that melatonin is potentially useful in the treatment of acute brain pathologies associated with excitotoxic neuronal damage such as epilepsy, stroke, and traumatic brain injury.

국문 초록 (Abstract)

Melatonin은 송과체에서 분비되는 신경호르몬으로 생리기능의 변화에 중요한 역할을 한다. 지금까지의 연구를 통해 melatonin은 여러 가지 신경독성물질로 유발되는 세포 사멸로부터 신경세포를 보호한다는 것이 밝혀졌다. 본 연구는 kainic acid (KA)에 의해 유도되는 신경흥분독성에 대한 melatonin의 보호기전을 쥐의 해마에서 규명하고자 하였다. 뇌실로 주입된 KA는 해마부위의 현저한 신경세포 사멸과 소교세포 활성화 그리고 소교세포 활성화에 따른 iNOS의 유도를 야기하였다. 조직병리학적 분석을 통해 KA 주입 1시간 전의 melatonin 투여가 KA로 유발되는 CA3 영역의 신경세포 사멸을 감소시킨다는 것을 확인하였다. 또한 OX-6 와 iNOS 항체의 면역반응성을 측정하여 Melatonin이 KA로 유발되는 소교세포 활성화와 그에 따라 발생하는 iNOS의 발현을 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
PI3K의 하부 효력기인 Akt는 흥분독성 손상과 같은 병리적인 신경세포 사멸에 있어 신경세포의 생존을 위한 중요한 매개물이다. Melatonin에 의해 Akt가 활성화 될 수 있는지 규명하기 위해 melatonin을 처치한 후 24시간 까지 해마의 CA3 영역에서 Akt 인산화 정도를 관찰하였다. Melatonin 처치 2시간 후부터 신경세포의 Akt 인산화 증가가 관찰되었다. 또한 melatonin은 성상세포의 Akt와 전사조절인자인 CREB을 인산화 시켰고, 신경성장인자인 GDNF와 TGF-β의 발현도 증가시켰다. CREB이 인산화된 Akt의 기질임을 고려하면 Akt의 인산화에 따른 CREB의 인산화가 GDNF와 TGF-β의 발현을 증가시킬 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 melatonin에 의한 성상세포의 Akt 인산화는 신경세포 보호의 중요한 기전 중 하나일 가능성이 있다.
이러한 성상세포의 Akt 인산화 기전을 규명하기 위하여 본 연구자는 PI3K의 특징적 억제제인 wortmannin과 melatonin 수용체의 비선택적 길항제인 luzindole을 melatonin 주입 전에 전처치 하였다. 그 결과 melatonin에 의해 유도되는 Akt의 인산화는 wortmannin에 의하여 완벽하게 억제되었고, luzindole에 의해서는 부분적으로 억제되었으며 GDNF와 TGF-β의 발현 또한 억제되었다.
본 연구자는 KA로 유발되는 신경흥분독성에 대한 melatonin의 신경보호 효과가 신경세포와 성상세포의 Akt 인산화, 그리고 소교세포 활성화의 억제를 통해서 이루어지는 것을 규명하였다. 따라서 본 논문은 간질, 발작, 외상성 뇌손상과 같은 흥분독성으로 인한 신경세포의 손상과 연관된 급성 뇌질환의 치료에 있어 melatonin이 사용 가능한 약물임을 제시하였다.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• 1. Kainic acid as an inducer of epilepsy 1
• 2. The role of astrocytes in neuroprotection 2
• 2.1. Defense against oxidative stress 3
• 2.2. Release of neuroprotective substances 5
• 3. Melatonin 6
• 4. Activation of Akt 9
• Objectives 11
• Materials and Methods 12
• 1. Animals and reagents 12
• 2. Drug treatments 13
• 3. Primary Astrocyte and glioma cell culture 14
• 4. Nissl (cresyl violet) staining 16
• 5. Immunohitochemistry 16
• 6. Double immunofluorescence labeling 18
• 7. In situ labeling of DNA fragmentation 20
• 8. RNA Isolation and RNase Protection Assay 21
• 9. Immunoblotting 22
• 10. Statistical analysis 24
• Results 25
• 1. Effects of melatonin on kainic acid-induced neuronal cell death 25
• 2. Melatonin can inhibit microglial activation induced by kainic acid injection 28
• 3. Effects of melatonin on astrocyte activation and Akt phosphorylation 32
• 4. Melatonin-mediated activation of Akt is PI3K dependent 42
• 5. Melatonin increases CREB phosphorylation via Akt phosphorylation 44
• 6. Melatonin-mediated Akt activation can increase neurotrophic factor expression 49
• Discussion 55
• References 64
• Abstract in Korean 86
• Acknowledgments 89