Cytoprotective and Anti-Aging Effects of Inonotus obliquus Extract via Anti-Oxidative Activity : 차가버섯 추출물의 항산화 활성에 의한 세포 사멸 저해와 항노화 효과

국문 초록 (Abstract)

차가버섯은 북위 45-50도의 러시아 캄카차 반도, 일본의 훗카이도 등과 같이 춥고 깊은 산에서 주로 발견되며, 자작나무에 붙어 자생하는 검은 색상의 담자균류로 알려져 있다. 이러한 차가버섯은 전통적으로 항암, 항종균, 면역증강, 항바이러스 및 항당뇨 효과 등과 같은 다양한 생리활성을 지닌다고 보고되고 있다. 특히, 근래에 알려진 바로는 차가버섯에서 분리된 색소성분이 항산화 효과에 탁월한 효능을 보인다고 보고된 바 있다. 하지만, 이렇듯 다양한 효능이 알려짐에도 불구하고, 산화적 스트레스로 인한 세포 사멸 저해와 노화억제에 관해서는 아직 보고되어지지 않았다. 따라서 본 연구의 목적은 차가버섯 추출물의 항산화 활성으로부터 산화적 스트레스로 가속화된 세포의 비정상적 사멸과 노화를 억제하고자 하였다. 또한, 광노화로 인한 피부 주름 생성을 막아 주름 개선 소재로써의 이용가능성을 평가하였다.
차가버섯 건조 분말 (20 g)은 증류수, 에탄올, 메탄올 (600 ml)의 세 가지 용매로부터 각각 추출되었다. 각각의 추출 수율은 열수로 추출 시 19.5%로 가장 높은 수율을 보였으며, 메탄올 (1.6%), 에탄올 (1.4%) 순으로 나타났다. 각 추출물들의 DPPH, 과산화수소, superoxide 자유 라디칼 소거능을 평가한 결과, 각각 70～98%, 50～60%, 25～33%로 비교적 높은 자유 라디칼 소거능을 보였다. 하지만, 산화적 스트레스로 인한 섬유아세포의 항사멸 효과를 평가하였을 시에는 열수 추출물만이 20% 이상의 저해 효과를 지니는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 효능을 보이는 열수 추출물이 산화적 스트레스로 인한 세포의 비 성숙한 노화를 억제 할 수 있을 것으로 판단하여, 활성 분획물로 열수 추출물을 선별하였다.
차가버섯 열수 추출물은 과산화수소에 노출된 섬유아 세포의 세포내 활성 산소종을 효과적으로 소거하였고, 세포의 지질과산화를 억제하였다. 산화적 스트레스는 세포자살의 특징인 세포의 DNA 파괴와 함께 세포 분열 주기를 정지 시켜 세포 자살을 유도하였으며, 세포의 형태를 변화시켰다. 하지만, 차가버섯 열수 추출물 처리 시, DNA 손상 및 세포의 비정상적인 형태를 저해하였고, 비교적 정상적인 세포분열을 유도하는 것을 확인하였다. 다음으로 세포 자살과 관련된 신호 전달 경로에서 차가버섯 열수 추출물의 작용 경로를 조사한 결과, Bax, caspase-3 와 AIF의 발현을 억제하였고, 항세포 사멸 인자인 Bcl-2의 발현을 유도함으로써 세포의 자살이 저해됨을 검증하였다. 또한, 산화적 스트레스는 세포의 비성숙한 노화를 야기 시켰으며, 교원질 분해 효소의 활성 증가와 함께 급속하게 교원질이 분해됨을 확인하였다. 이러한 세포의 비성숙한 노화 현상은 차가버섯 추출물의 존재 하에 효과적으로 저해 될 수 있음을 확인하였다. 세포의 노화와 밀접하게 관련 되어 있는 MAPK 신호 전달 경로에서는 ERK 1/2 와 JNK의 인산화를 선택적으로 저해한다는 것을 알 수 있었다. 이로부터 산화적 스트레스로 유도된 세포의 노화는 차가버섯 열수 추출물로 인해 효과적으로 억제 될 수 있음을 검증하였다.
또한, 차가버섯 열수 추출물의 면역 강화능을 평가한 결과, 대식세포의 활성을 유도하여 NO 의 생성 및 대식작용을 증가시켜 면역강화 효과를 지니는 것으로 나타났다.
끝으로, in vivo 실험으로 12주간 자외선 B를 hairless mice에 조사시켜 주름 생성 정도와 피부 두께를 확인한 결과, 차가버섯 열수 추출물 처리 시 주름 생성이 저해 되는 것을 확인하였고, 피부 두께 역시 자외선 조사되지 않은 대조군과 비교적 유사한 피부 두께를 유지하는 것으로 나타났다.
이상의 연구 결과로부터 차가버섯 열수 추출물은 산화적 스트레스로 인한 세포의 사멸과 비성숙한 노화를 저해 할 수 있음을 확인하였다. 또한 광노화로 인한 피부주름을 예방 및 개선 할 수 있는 새로운 천연 소재로써의 이용 가능성을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• I. Introduction 1
• II. Materials and Methods 16
• 2. 1. Preparation of I. obliquus extracts 16
• 2. 1. 1. Extraction procedure 16
• 2. 2. Anti-oxidative activity 18
• 2. 2. 1. DPPH radical scavenging activity 18
• 2. 2. 2. Hydrogen peroxide scavenging activity 18
• 2. 2. 3. Superoxide radical scavenging activity 19
• 2. 3. Cell culture 20
• 2. 4. Cytoprotective effect of I. obliquus extract on H2O2-induced apoptotic cell death via anti-oxidative activity 21
• 2. 4. 1. Cell viability assay 21
• 2. 4. 2. Intracellular ROS scavenging activity 22
• 2. 4. 3. Lipid peroxidation analysis 23
• 2. 4. 4. Detection of apoptosis by flow cytometry 23
• 2. 4. 5. Nuclear staining with propidium iodide 24
• 2. 4. 6. Western blotting 25
• 2. 5. Effect of I. obliquus extract on H2O2-induced premature senescence 26
• 2. 5. 1. Zymography analysis 26
• 2. 5. 2. Collagen assay 27
• 2. 5. 3. SA-β-galactosidase staining 27
• 2. 5. 4. Cell proliferation assay 28
• 2. 6. Effect of I .obliquus extract on UV-B irradiation-induced skin winkle and thickness 29
• 2. 6. 1. Animals 29
• 2. 6. 2. UV irradiation and sample application 29
• 2. 6. 3. Determination of skin winkle 30
• 2. 6. 4. Measurement of skin fold thickness 30
• 2. 7. Immune activity of I. obliquus extract on the innate immune response in RAW 264.7 cells 31
• 2. 7. 1. NO assay 31
• 2. 7. 2. Phagocytosis analysis 31
• III. Results and Discussion 32
• 3. 1. Preparation of I. obliquus extracts 32
• 3. 1. 1. Yield of I. obliquus extracts 32
• 3. 2. Anti-oxidative activity 35
• 3. 2. 1. Scavenging activity of DPPH radical, hydrogen peroxide and superoxide 35
• 3. 3. Cytoprotective effect of I. obliquus extract on H2O2-induced apoptotic cell death via anti-oxidative activity 37
• 3. 3. 1. Cytotoxicity of I. obliquus extracts and H2O2 37
• 3. 3. 2. Cytoprotective effect on H2O2-induced cell death 40
• 3. 3. 3. Inhibitory effect on morphologic changes induced by H2O2 40
• 3. 3. 4. Inhibitory effect on intracellular ROS generation 43
• 3. 3. 5. Inhibitory effect on lipid peroxidation 43
• 3. 3. 6. Inhibitory effect on apoptosis induced by H2O2 47
• 3. 3. 7. Effect on the cell cycle arrest and DNA fragmentation according to apoptosis induced by H2O2 50
• 3. 3. 8. Effect on the expression of apoptosis-related proteins 55
• 3. 4. Inhibitory effect of I. obliquus extract on H2O2-induced premature senescence in human dermal fibroblasts 58
• 3. 4. 1. Inhibitory effect on activity of MMPs increased by H2O2 58
• 3. 4. 2. Effect on collagen degradation induced by H2O2 59
• 3. 4. 3. Repressive effect on H2O2-induced premature senescence 62
• 3. 4. 4. Inhibitory effect on selective MAPK activation by H2O2 71
• 3. 5. Effect of I. obliquus extract on UV-B irradiation-induced skin winkle and thickness in hairless mice 75
• 3. 5. 1. Effect on UV-B-induced skin wrinkle formation 75
• 3. 5. 2. Effect on UV-B-induced skin thickening 75
• 3. 6. Immunoactivity of I. obliquus extract on the innate immune response in RAW 264.7 cells 78
• 3. 6. 1. Effect on NO production 78
• 3. 6. 2. Effect on phagocytic uptake 80
• IV. Conclusion 83
• References 87
• Abstract 101