Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Expression by Brain-specific Angiogenesis Inhibitor 2 : 뇌 특이 혈관형성 억제유전자2에 의한 혈관내피세포 성장인자의 발현 조절 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Previously, it was reported that the decreased expression of brain-specific angiogenesis inhibitor 2 (BAI2) by anti-sense strategy induced the increased vascular endothelial growth factor (VEGF) expression. However, its intracellular mechanism is not fully understood. In this study, the author found that GA-binding protein gamma (GABPγ), the ETS-related transcription factor, was associated with the cytoplasmic domain of BAI2 through the yeast two-hybrid assay. The whole portion of GABPγ interacted with the cytoplasmic domain of BAI2 more than N-terminal portion containing ankyrin repeats, middle portion of GABPγ that is conserved between GABPβ and GABPγ or C-terminal portion containing GABPβ- or GABPγ-specific region. RT-PCR analyses of GABPγ cDNA transfected SHSY5Y neuroblastoma cells revealed increased GABPγ expressions but a decreased VEGF expression. Also, transcriptional activity of VEGF was decreased when either GABPα/β or GABPα/γ cDNAs were co-transfected with VEGF promoter-luciferase construct into monkey kidney fibroblast (CV-1) cells. The gel mobility-shift assays showed that in vitro translated GABPα protein did form the complex, which was abrogated with an addition of anti-GABPα antibody, indicating that GABPα/β or GABPα/γ participated as a transcription factor in the regulation of VEGF expression. In in vitro hypoxic cell culture model by cobalt treatment, GABPα and GABPγ expressions decreased concomitantly with BAI2 after the time course of hypoxia, and they preceded the increased VEGF expression in the SHSY5Y cells. The relocation of GABPγ to the transmembrane region was observed at 2 h, when BAI2 expression was returned to the basal level after acute dropping. It indicated that the available GABP transcription factor was sequestered to the cell membrane rather than nucleus with the deactivation of BAI2, thereby leading to the increased VEGF expression. These results suggest that angiostatic BAI2 suppresses and also redistributes GA-binding protein through binding to its cytoplasmic domain, regulates the angiogenic VEGF expression at the promoter level, and thereby controls brain angiogenesis.

국문 초록 (Abstract)

뇌 특이 혈관형성 억제유전자 2(BAI2)의 발현을 anti-sense방법에 의해 감소시키면 혈관 내피세포 성장인자(VEGF)의 발현이 증가됨이 보고 되었으나 그 세포내 조절 기전은 밝혀지지 않았다. 본 연구에서 저자는yeast two-hybrid assay를 이용하여 전사 인자인 GA-결합 단백 gamma (GABPr)가 BAI2의 세포질내 도메인과 결합하고 있음을 발견하였다. GABPr 의 전체 부분이 N-말단, GABPr와GABPβ의 중간부분 및 C-말단 보다 더 BAI2의 세포질내 도메인과 잘 결합하였다. 역전사 효소-중합효소 연쇄반응 분석을 통해GABPr cDNA를 형질 도입한 SHSY5Y 뇌종양세포에서 GABPr의 발현이 증가하나 VEGF의 발현은 감소함이 관찰되었다. GABPα/r나 GABPα/β를 VEGF promoter-luciferase construct와 함께 CV-1세포에 동시에 형질 도입시키면VEGF의 전사가 감소하였다. GABPα단백은VEGF promoter에 결합하고 이는GABPα항체 존재 하에 감소됨이 gel mobility-shift assay를 통해 관찰되었다. 이는GABPα/r나 GABPα/β가VEGF 발현 조절에 전사인자로 작용하고 있음을 가리킨다. 배양된 SHSY5Y 세포에 코발트를 처리하여 세포 허혈 상태를 유지시키면 초기 2시간 이내에 GABPr의 발현이BAI2의 발현감소와 동시에 감소하였으나 반면GABPβ는 증가하였다. 그러나 세포 허혈 유지 8시간에HIF-1α와 VEGF의 발현 증가는 최고치를 보였고 이때BAI2, GABPα, GABPr는 현저히 감소하여 서로 역상관 관계를 보였다. 이 중2시간 이내BAI2와GABPr의 발현감소는 2시간 이후의 VEGF의 발현 증가에 선행하였다. 이때 GABPr는 코발트 처리 2시간에 오히려 세포막으로 이동되는 것이 관찰되었다. 이는 세포 허혈 초기에BAI2의 발현 감소시 GABPr가 BAI2의 세포질 도메인에 결합함으로써 VEGF의 발현을 억제 시키는 전사인자 GABPα/GABPr의 발현 감소를 초래하고, 또한 GABPα전사인자의 핵내 진입을 돕는GABPr를 핵보다는 세포막으로 이동하게 하여 결국은 VEGF의 발현 증가를 유도하고 있음을 가리킨다. 본 실험결과는 세포 허혈 초기에BAI2가 전사인자인 GABP 결합단백의 감소와 재분포를 통해 VEGF의 발현을 promoter 수준에서 조절한다는 것을 시사한다.

목차 (Table of Contents)

• Contents
• Abstract = 1
• INTRODUCTION = 3
• MATERIALS AND METHODS = 6
• RESULTS = 17
• DISCUSSION = 34
• CONCLUSION = 41
• REFERENCES = 43
• 국문초록 = 50