핵 형성 유도제로서의 금나노입자를 이용한 단백질 결정화 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Protein crystallization is a necessary, but time-consuming and difficult step in structure determination by crystallography. The rate-limiting step of crystallization is nucleation, where protein monomers in solution cluster in an ordered fashion to form a stable nucleus. Here, we propose the use of gold nanoparticles to accelerate nucleation and enhance crystal formation. We tested whether gold nanoparticles can facilitate nucleation by interacting with target proteins and inducing favorable clustering. We used differently sized gold nanospheres and gold nanostars to crystallize hen egg-white lysozyme and bovine serum albumin (BSA). Our results indicated that gold nanoparticles significantly increased the number of crystallization conditions (by about 20 %). Spherical and larger gold particles were found to be more efficient. Furthermore, the use of gold nanoparticles did not have any adverse effect on data collection or structure determination. Also, we additionally used gold nanorods for crystallizing His6-tagged proteins with various properties to characterize oriented nucleation effect of gold nanoparticles. Our findings indicate that the use of nanoparticles as protein nucleation-inducing reagents can greatly accelerate structure determination by X-ray crystallography.

국문 초록 (Abstract)

단백질의 결정화는 X선 회절데이터의 수집을 위해서 반드시 필요한 과정이나 원론적인 이론 외에는 개별적인 단백질의 결정화를 예측할 수 있는 방법은 알려져 있지 않다. 단백질의 결정화에 영향을 주는 요소들로서 침전제, pH, 온도, 압력 등 여러 가지 요소가 연구되어 왔지만 각각의 단백질들의 결정화 조건은 모두 다르기 때문에 결정화 과정은 시행착오를 겪어야 하는 과정으로 남아있다. 이러한 단백질의 결정화에 있어서 가장 중요한 단계인 핵 형성은 용액에 단일체로 존재하던 단백질들이 모여 일정한 크기 이상의 안정적인 핵을 형성하는 과정이다. 따라서, 핵의 형성을 유도하는 것은 단백질 결정화의 성공률을 높일 수 있는 중요한 방법이다. 본 논문에서는 핵 형성 유도제로서 금나노입자를 이용함으로써 핵 형성을 촉진시키는 방법에 대해 연구하였다. 다양한 크기의 구형 및 성형 금나노입자를 이용하여 라이소자임의 결정화를 진행한 결과, 금나노입자가 라이소자임의 결정화 조건의 수를 약 20% 증가시켰다. 이는 알부민에도 동일한 효과를 보이며 금나노입자가 라이소자임 이외의 단백질의 결정화에도 핵 형성 유도 효과를 보임을 확인하였다. 또한, 금나노입자가 구형에 가까울수록, 크기가 커질수록 효과적으로 결정화가 진행되었고, 금나노입자를 사용하는 것이 X선 데이터를 수집하거나 구조를 규명하는 전반적인 과정에서 어떠한 영향도 미치지 않음을 확인하였다. 현재 다양한 모양의 금나노입자가 단백질 결정화에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여 기둥 모양의 금나노입자를 추가할 뿐만 아니라 단백질 분자가 핵 형성을 위해 모이는 방향이 결정화에 주는 효과를 확인하기 위하여 단백질의 말단에 히스티딘 태그를 추가하여 결정화 실험을 진행하고 있다. 이를 통해 금나노입자를 이용한 단백질의 핵 형성 유도는 결정화 과정을 촉진시킬 수 있는 방법을 제공하여 X선 결정학의 획기적 발전에 기여할 수 있다.

목차 (Table of Contents)

• 1. INTRODUCTION 1
• 2. MATERIALS AND METHODS 4
• 2.1 Materials 4
• 2.2 Cloning, expression, purification of His6- RhoA and His6-β-catenin 5
• 2.3 Cloning, expression, purification of His6- Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446 6
• 2.4 Preparation of gold nanostars 7
• 2.5 Transmission electron microscopy 7
• 2.6 Characterization of lysozyme-conjugated gold nanoparticles via dark-field spectroscopy 8
• 2.7 Crystallization, data collection, and structure determination 9
• 3. RESULT AND DISCUSSION 14
• 3.1 Use of hen egg white lysozyme to verify the effect of gold nanoparticles as nucleation inducer 14
• 3.1.1 Conjugation of lysozyme to the surface of gold nanoparticles 15
• 3.1.2 Effects of gold nanoparticles on the crystallization of lysozyme 21
• 3.1.3 Data collection and structure determination of lysozyme 29
• 3.2 Use of His6-tagged proteins to verify the effect of gold nanoparticles as oriented nucleation inducer 34
• 3.2.1 Purification and crystallization of His6-tagged proteins 35
• 3.2.2 Refolding of His6-tagged lysozyme 41
• 4. CONCLUSION 45
• 5. REFERENCE 46
• 국문초록 51
• 감사의 글 53