Horseradish peroxidase의 안정화를 위한 신규 공융용매의 개발 = Development of Novel Deep Eutectic Solvents for Stabilizing Horseradish Peroxidase

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Enzyme utilization in industrial processes represents a sustainable approach; however, the intrinsic instability of enzymes in water-soluble states poses a formidable challenge. Current methods, such as the use of organic solvents or ionic liquids for enzyme stabilization, are not only environmentally unfriendly but also entail toxicity. Consequently, there is a pressing need for the development of innovative solvents. This study focuses on the synthesis of 11 deep eutectic solvents (DESs) to evaluate their efficacy as stabilizing agents for horseradish peroxidase (HRP). A distinctive feature of this investigation is the application of trimethylamine-N-oxide (TMAO), a known protein stabilizer, as a novel DES solvent. The experimental findings reveal that the DES formulated with betaine and TMAO, utilizing triethylene glycol (TG) as a hydrogen bond donor (HBD), emerges as a superior cosolvent for stabilizing HRP. Storage of HRP in 10% betaine-TG (BTG) and TMAO- TG (TTG) DES aqueous solutions demonstrates consistent activity across a broad pH range (4.0 to 8.0), indicating exceptional pH stability. Furthermore, HRP in BTG and TTG solutions exhibits remarkable thermal stability at 25℃, boasting a half-life of 6.7 and 7.2 times longer than that in free buffer, respectively. Intriguingly, the use of DES as a cosolvent surpasses the performance of a simply mixed solvent of BTG and TTG, extending the half-life by 1.6 times, emphasizing the pivotal role of DES formation. Solvatochromic parameter analysis provides valuable insights into characteristic changes during the DES formation process. Extended melting times of up to 3 hours correlate with a decrease in dipolarity/polarizability (π*) values and an increase in hydrogen bond acidity (α) values. Differential Scanning Calorimeter (DSC) results indicate an elevated peak temperature attributed to DES formation. Examining the impact of DES on HRP's structural changes, soret band analysis establishes a significant correlation between alterations in heme structure and HRP stability. Circular Dichroism (CD) spectroscopy further uncovers a connection between reduced α-helix in HRP's secondary structures and enzyme inactivation. Given the limited existing studies on betaine and TMAO-based DES, this research anticipates that the observed correlations will inform and guide future investigations into enzyme stabilization, encompassing various enzymes and DES formulations. Keyword : Horseradish Peroxidase(HRP), stability, Deep eutectic solvents, Betaine, Trimethylamine-N-oxide, Solvatochromic parameters

국문 초록 (Abstract)

효소를 사용하는 방식은 산업적으로 친환경적인 방식이지만 수용성 상태에서 사용할 때는 안정성이 많이 떨어지기 때문에 효소의 안정화는 중요한 사안이다. 효소의 안정화 방식 중 하나인 유기용매나 IL을 조용매를 쓰는 방식은 유독하고 친환경적이지 못하다는 단점으로 신규용매의 개발이 요구되고 있다. 본 연구에서는 11종류의 Deep eutectic solvent(DES)를 제조하여 horseradish peroxidase(HRP)에 대한 안정화 조용매로서의 활용 가능성을 탐구하였다. DES는 유기용매보다 유독하지 않으며 IL보다 경제적이다는 장점을 가진다. 이 연구에서는 trimethylamine-N-oxide(TMAO)를 신규 DES 용매로 개발하였다. 단백질 안정화 물질인 betaine과 TMAO를 기반으로 한 DES를 이용해 HRP를 안정화한 실험을 진행한 결과, triethylene glycol(TG)를 hydrogen bond donor(HBD)로 제조한 DES는 HRP의 안정화에 가장 탁월한 조용매로 나타났다. 10% Betaine-TG(BTG), TMAO-TG(BTG) DES 수용액에 저장된 HRP는 pH 4.0-pH 8.0조건에서 안정적인 활성을 나타내 우수한 pH 안정성을 보였다 25℃에서 유리완충액에서보다 반감기가 각각 6.7배, 7.2배 긴 안정성을 가졌다. 또한 BTG, TTG 각각의 성분을 단순 혼합해 조용매로 사용했을 때 보다 DES를 사용한 경우 각각 1.6배 긴 반감기를 가져 DES 형성 자체의 중요성이 나타났다. DES의 형성하는 과정에서의 특성 변화를 조사하기 위해 solvatochromic parameter를 분석하였다. DES를 형성하는 과정에서 DES의 용융 시간이 증가함에 따라 3시간까지 쌍극성/분극성을 나타내는 π* 값은 감소하였고 수소결합을 주는 능력(hydrogen bond acidity) α값은 증가했다. DES의 열 전이를 보기 위해 Differential Scanning Calorimetry (DSC)를 수행해 수소결합으로 인해 전반적으로 피크가 높은 온도에서 나타난 것을 알 수 있었다. 마지막으로 DES가 HRP의 구조적 변화에 미치는 영향을 보기위해 soret band와 Circular Dichroism (CD) spectroscopy를 측정하였다. Soret band 분석을 통해 DES에 따른 heme 구조의 변화와 활성적 안정성에 대한 유의한 상관관계를 알 수 있었으며 CD spectroscopy를 통해 HRP의 2차구조 중 α-helix의 감소가 HRP의 불활성화에 지대한 영향을 미치는 것으로 드러났다. 아직 betaine과 TMAO 기반 DES에 대한 연구가 적기 때문에 본 연구에서 신규 DES 형성과정에 따른 물리 화학적 특성과 효소의 구조적, 활성적 안정성 간의 상관관계를 이용해 향후 다양한 효소와 DES를 이용한 안정화 연구에 적용할 수 있다고 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• 표 목차 ⅲ
• 그림 목차 ⅳ
• ABSTRACT ⅴ
• 제1장 서론 1
• 제1절 Horseradish peroxidase (HRP) 1
• 제2절 Deep Eutectic Solvent(DES) . 2
• 제3절 Solvatochromic Parameter . 4
• 제4절 DES의 조용매로서 HRP에 미치는 영향 . 6
• 제5절 연구 목적 . 7
• 제2장 실험재료 및 방법 . 8
• 제1절 실험재료 8
• 제2절 HRP의 안정성과 활성에 DES가 미치는 영향 . 8
• 1. DES 제조 8
• 2. DES 포함 완충용액 제조 . 10
• 3. HRP의 활성에 DES가 미치는 영향 10
• 4. HRP의 안정성에 DES가 미치는 영향 10
• 5. DES 포함 완충 용액에서 HRP의 pH 안정성 측정 11
• 7. DES 형성 시간에 따른 HRP의 안정성 측정 . 11
• 제3절 DES의 물리화학적 특성 12
• 1. Solvatochromic parameter 12
• 2. Differential Scanning Calorimetry (DSC) 13
• 제4절 DES로 인한 HRP의 구조적 특성 13
• 1. Soret band 측정 13
• 2. Circular Dichroism (CD) spectroscopy 13
• 제3장 결과 및 고찰 14
• 제1절 HRP의 안정성과 활성에 DES가 미치는 영향 14
• 1. DES의 제조 14
• 2. HRP의 활성에 DES가 미치는 영향 15
• 3. HRP의 안정성에 DES가 미치는 영향 17
• 4. DES 포함 완충 용액에서 HRP의 pH 안정성 측정 20
• 5. DES 농도에 따른 HRP의 안정성 측정 . 23
• 6. DES를 구성하는 각성분에 따른 HRP의 안정성 측정 26
• 7. DES 형성 시간에 따른 HRP의 안정성 측정 . 28
• 제2절 DES의 물리화학적 특성 30
• 1. Solvatochromic parameter 30
• 2. Differential Scanning Calorimetry (DSC) 34
• 제3절 DES로 인한 HRP의 구조적 특성 36
• 1. Soret band 측정 36
• 2. Circular Dichroism (CD) spectroscopy 40
• 제4장 결론 . 43
• 참고문헌 45
• 국문 초록 52