애기장대의 poltergeist 돌연변이 배경에서 선별된 두 개의 약한 지상부 결함 돌연변이들의 특성 규명 = Characterization of two weak shoot defective mutants screened in the background of poltergeist in Arabidopsis

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

ABSTRACT

Characterization of weak shoot defective mutants in the
background of poltergeist mutant in Arabidopsis
Young-Bin Yun
Advisor : Assistant Prof. Sang-Kee Song, Ph.D.
Department of Life Science,
Graduate School of Chosun University
Partial loss-of-function mutants could be useful to understand fine
functions of a gene of which a null mutation leads to severe defects such as
lethality and lack of organ development. poltergeist (pol) mutant provides a
proper sensitized background to screen for weak shoot defective mutants that
is hardly found in the wild-type background. Here, filamentous gynoecium-1
(fig-1) pol-6 double mutant displaying slightly reduced floral meristem has
been screened from a mutant pool induced by the introduction of activation
tags in the pol-6 background. The T-DNA insertion site was localized in the
promoter region of a homeo-domain gene, SHOOTMERISTEMLESS (STM)
by using next generation sequencing analysis. fig-1 single mutant exhibited
vi
defects in floral organ abscission mainly due to the fusion of sepals. Two
additional weak alleles, each possessing a T-DNA insertion in the promoter,
stm-p1 and stm-p3 also exhibited weak inflorescence defects together with
abscission defects. Furthermore, stm-p1 pol-6 displayed filamentous
gynoecium phenotype. The reverse-transcription PCR analysis showed that
STM expression in fig-1, stm-p1 and stm-p3 was reduced compared with
that in wild-type plants. Interestingly, the width of abscission zone (AZ) of
fig-1, stm-p1, and stm-p3 was shorter than that of WT while the length of
the siliques. The expression pattern of floral abscission related genes such as
HAESApro:GUS, KNAT2pro:GUS, KNAT6pro:GUS, and KNAT1pro:GUS in
the stm-p1 was not changed as compared with that in WT suggesting that
STM is involved in the development of sepal boundary and the growth of AZ
rather than in the canonical pathway for the floral AZ development.
POLTERGEIST (POL) and POL-LIKE1 (PLL1) coding for related protein
phosphatase 2C (PP2C) are required for the establishment of shoot and root
meristems during embryogenesis. As strong pol pll1 double mutants are
seedling-lethal due to the lack of vasculature along the embryo axis, their
late vegetative and reproductive phenotypes could only be observed only
after grafting. To avoid any artificial effect possibly led by grafting, a weak
pll1 allele (pll1-4) has been selected among the T-DNA insertion mutants
and a partial loss-of-function double mutant (pol-6 pll1-4) has been
prepared. About 10% of pol-6 pll1-4 seedlings developed vasculature in the
hypocotyl and were able to exhibit post-embryonic phenotypes
vii
spontaneously. The above-ground organs of pol-6 pll1-4 phenocopied
wuschel mutant displaying adventitious phyllotaxis and inflorescence and
defective flowers lacking any gynoecium together with reduced CLV3pro:GUS
expression. The phenotypes of pol-6 pll1-4 clv2-1 and pol-6 pll1-4 clv3-
2 were similar to that of pol-6 pll1-4 suggestive of the epistasis between
POL/PLL1 and CLVs. In addition, pol-6 pll1-4 exhibited severely reduced
root meristem as shown by the reduced expression of root meristem markers
such as WOX5pro:GUS which was further confirmed with reporter expression
such as WOX5pro:GUS and SCRpro:GUS, Unexpectedly, the pll1-4 mutation
leading to the weak pol-6 pll1-4 was identified as a point mutation in an
amino acid located in one of the conserved PP2C motifs instead of the TDNA
insertion localized in the promoter region of PLL1.

국문 초록 (Abstract)

국문초록

애기장대의 poltergeist 돌연변이 배경에서 선별된 두 개의
약한 지상부 결함 돌연변이들의 특성 규명

윤영빈
지도교수 : 송상기
생명과학과
조선대학교 대학원
돌연변이가 치사성이나 기관의 소실 등의 심각한 결함을 초래하는 경우, 부분적인
기능 상실 돌연변이는 유전자의 정교한 기능을 이해하는데 유용하다. poltergeist
(pol) 돌연변이는 야생형 배경에서는 거의 발견되기 어려운 미약한 경단 분열조직
돌연변이를 선별하기 위한 적절히 민감한 배경을 제공한다. 본 연구에서 pol-6
배경에 활성표지를 도입한 돌연변이 식물의 pool 에서 산발적으로 실 모양의
암술군을 형성하는 열성돌연변이인 filamentous gynoecium-1 (fig-1) pol-6
이중돌연변이를 선별하였다. 차세대 시퀀싱 분석을 이용하여 T-DNA 는 homeodomain
전사인자를 암호화하는 SHOOTMERISTEMLESS (STM)의 프로모터에
삽입된 것을 확인하였다. fig-1 단일 돌연변이는 꽃 받침의 융합으로 인하여 꽃
ix
기관의 탈리에 결함이 나타났다. STM 프로모터에서 T-DNA 가 삽입된 두 개의
약한 돌연변이인 stm-p1 과 stm-p3 도 꽃 기관의 탈리에 결함과 함께 약한
화서 결함 표현형을 나타냈다. 또한, stm-p1 pol-6 이중돌연변이는 실 모양의
암술군의 표현형을 재현하였다. Reverse-transcription PCR 의 결과 fig-1, stmp1,
그리고 stm-p3 돌연변이에서는 야생형 식물에 비하여 낮은 수준으로
STM 이 발현되었다. 흥미롭게도 fig-1, stm-p1 및 stm-p3 의 탈리대의 폭은
야생형의 것에 비하여 감소한 반면, 세 돌연변이들의 silique 의 길이는 야생형의
것과 큰 차이가 없었다. 또한, stm-p1 돌연변이에서 HAEpro:GUS,
KNAT2pro:GUS, KNAT6pro:GUS 및 KNAT1pro:GUS 등의 꽃 기관의 탈리대
관련 리포터 유전자들의 발현양상은 야생형에서의 발현양상과 차이가 나타나지
않았다. 이러한 결과들은 STM 이 전형적인 꽃 기관의 탈리대 발달 경로에
관여하기보다는 꽃받침의 경계형성과 탈리대의 생장에 관여한다는 것을 암시한다.
단백질 탈인산화효소를 암호화하는 POLTERGEIST (POL)와 POL-LIKE1
(PLL1)은 배발생과정에서 경단 및 근단분열조직의 형성에 필요하다. 강한 pol
pll1 이중돌연변이는 배의 중축에서 관다발을 형성되지 않기 때문에 유식물
치사성이며, 접목 없이는 후기 영양생장단계와 생식단계의 표현형을 관찰할 수
없다. 본 연구에서는 접목에 의해 야기되는 인위적인 효과를 피하고자, 약한 pll1
대립유전자(pll1-4)를 T-DNA 삽입 돌연변이들 중에서 선택하여 부분적인
기능상실 이중 돌연변이(pol-6 pll1-4)를 제조하였다. pol-6 pll1-4 의 유식물
중에서 약 10%가 관다발을 형성하여 자발적으로 생장하여 후배발생적 표현형을
나타냈다. pol-6 pll1-4 의 지상부에서는 CLV3pro:GUS 의 발현이 감소하였고,
부정기적인 잎차례 및 꽃차례, 그리고 암술이 결핍된 결함이 있는 꽃의 표현형을
나타냈으며, 이는 wuschel 돌연변이의 표현형을 모사하는 것이었다. pol-6 pll1-
x
clv2-1 과 pol-6 pll1-4 clv3-2 삼중돌연변이의 표현형은 pol-6 pll1-4 이중
돌연변이의 표현형과 대등하였으며, 이는 POL/PLL1 과 CLV 들 사이에
유전학적인 상위 관계가 있음을 암시한다. 또한, pol-6 pll1-4 에서는
근단분열조직이 심하게 감소되었는데 이러한 현상은 WOX5pro:GUS 와
SCRpro:GUS 같은 근단분열조직 표지 유전자의 발현이 감소된 것에서 잘
나타났다. 예상 밖의 현상으로, 약한 pol-6 pll1-4 이중돌연변이를 유도하는
pll1-4 돌연변이는 PLL1 프로모터 지역의 T-DNA 삽입에서 유래한 것이 아니라
보존된 PP2C 모티프의 점 돌연변이에서 유발된 것임을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS
• LIST OF TABLES……………………………………i
• LIST OF FIGURES…………………………………ii
• ABBREVIATIONS…………………………………ⅲ
• ABSTRACT…………………………………………ⅴ
• 국문초록………………………………………………ⅷ
• I. 서론…………………………………………………1
• 1. 모델식물 애기장대………………………………………1
• 2. 식물의 배 발생……………………………………………2
• 3. CLAVATA 신호전달 경로………………………………3
• 4. CLV-WUS 신호전달에 관여하는 POLTERGEIST
• 유전자……………………………………………………4
• 5. 식물의 탈리 현상…………………………………………4
• 6. 꽃 기관의 탈리……………………………………………6
• 7. IDA 신호전달 경로………………………………………8
• 8. 약한 경단분열조직 돌연변이의 선별의 필요성……10
• II. 재료 및 방법……………………………………12
• 1. 식물재료 및 생장조건…………………………………12
• 2. Genomic DNA 추출……………………………………13
• 3. 중합효소연쇄반응………………………………………13
• 4. Thermal asymmetric interlaced PCR………………14
• 5. PCR 산물의 정제와 전기영동…………………………15
• 6. Ligation…………………………………………………15
• 7. 형질전환…………………………………………………16
• 8. 콜로니 PCR………………………………………………16
• 9. Plasmid DNA prep……………………………………16
• 10. GUS 발현의 정성적 분석……………………………17
• 11. Reverse Transcription PCR………………………17
• III 결과………………………………………………18
• 1. 35S enhancer 활성표지를 이용한 pol-6 배경에서
• fig-1 돌연변이의 선별………………………………18
• 2. fig-1 돌연변이의 T-DNA 삽입위치 확인………20
• 3. T-DNA 삽입 돌연변이 검정………………………22
• 4. 탈리대 관찰 결과………………………………………26
• 5 . 탈리대 형성에 관여하는 리포터 유전자 발현
• 양상 확인………………………………………………29
• 6. 약한 pol과 pll1 돌연변이 대립유전자의 교차에 의한
• 비-유식물 치사성 pol pll1 이중 돌연변이 선별…34
• 7. 후-배발생과정에서 pol-6 pll1-4는 wus의 표현형을
• 모 사 … … … … … … … … … … … … … … … … 3 9
• 8. PCR 및 염기서열분석을 통한 pll1-4 점 돌연변이의
• 확인………………………………………………………43
• IV 논의………………………………………………44
• V 참고문헌……………………………………………49