Studies on the Expression of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 in Mouse Uterus : 생쥐 자궁조직에서의 ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, 그리고 ADAMTS-1의 발현에 관한 연구

국문 초록 (Abstract)

포유류의 수정과 배발생 과정은 모체의 생식기관 내에서 이루어지는데, 그 중에서도 자궁은 배아의 지속적인 발생을 가능하게 하는 부위로써 매우 중요한 역할을 한다. 난소에서 난포내의 난자가 성숙하여 수란관으로 배란되어 이곳에서 정자와의 수정이 이루어지는 동안 자궁에서는 배아의 착상을 위한 변화를 일으킨다. 생식주기에 따른 이같은 자궁조직의 구조적, 기능적인 변화 즉 조직재구성 (tissue remodeling)은 내분비호르몬에 의해 주도되며 여러 가지 growth factor와 cytokine 등에 의해 조절된다. ADAM (a disintegrin and metalloprotease)은 disintegrin domain과 metalloprotease domain 등으로 이루어져 있는 새로운 단백질 군이며, 이들은 integrin과의 binding을 통한 cell adhesion, 세포막 부착 단백질 혹은 생체신호전달물질이 세포로부터 분비될 때에 이들의 구조를 변화시켜 활성화시키는 효소로서의 기능을 가지고 있다. 현재까지 서른 가지가 넘는 종류가 밝혀졌으나 그 생물학적 기능, 특히 생식기관에서의 기능에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 생쥐의 자궁조직을 대상으로 ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, 그리고 ADAMTS (a disintegrin and metalloprotease thrombospondin motifs) -1을 선정하여, 생식주기동안과 초기 임신 기간에서의 이들의 유전자 및 단백질의 발현여부를 시간적 및 공간적으로 조사하였고 이 결과를 바탕으로 자궁조직에서의 이들 유전자들의 생리적인 기능을 규명하고자 하였다.
조사된 ADAM 유전자들은 생식주기에 상관없이 모든 시기의 자궁조직에서 유전자가 발현되었으나, 항상 diestrus 시기에서 가장 적게 발현되었다. 이 중 ADAM-8의 유전자 전사체는 proestrus 시기에서 가장 많이 발현되었으며, ADAM-9와 ADAMTS-1의 유전자 전사체는 estrus 시기에서 가장 많이 발현되는 것으로 나타났다. 한편 ADAM-10, -12, -15, 그리고 -17의 경우는 생식주기 동안 유전자 전사체의 발현이 유의한 차이를 보이지 않았다. Immunoblotting 방법을 이용하여 ADAM 단백질의 발현양상을 조사한 결과, 모든 시기의 자궁조직에서 단백질이 발현되었다. 그러나 단백질의 발현 양상은 생식주기의 시기별로 조사된 ADAM 종류에 따라 다양하였다. ADAM-8, -12, 그리고 -17의 경우는 diestrus 시기에서 가장 적게 단백질이 발현되었으며 proestrus 시기에서 가장 많이 발현되는 것으로 나타났다. ADAM-9, -10, 그리고 ADAMTS-1의 단백질은 생식주기가 진행됨에 따라 서서히 그 양이 증가하였고, ADAM-9는 estrus시기에서 ADAM-10과 ADAMS-1은 metestrus 시기에서 가장 강하게 발현되었다. ADAM-15의 단백질의 발현은 diestrus 시기에서는 아주 약하였으나 proestrus 그리고 estrus 시기에서 현저하게 그 양이 증가되었다. Immunohistochemistry 방법을 이용하여 ADAM의 공간적인 발현을 조사한 결과, 이들은 주로 luminal epithelium과 glandular epithelium에 분포하는 것으로 나타났으며 그 양상은 생식주기의 시기별로 조사된 ADAM 종류에 따라 다양하였다. 이러한 결과로 미루어 본 연구에서 조사된 ADAM 단백질은 생쥐의 생식주기 동안 일어나는 자궁조직의 재구성에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
난소가 제거된 생쥐를 이용하여 자궁조직에서의 ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, 그리고 ADAMTS-1의 유전자의 발현이 생식호르몬에 의하여 조절되는 지를 알아보았다. 암컷 생쥐의 난소를 제거하고, 2주 후에 sesame oil, 17β-estradiol (E2), progesterone (P4) 혹은 이 둘 혼합액 (E2+P4)을 피하 주사하였다. RT-PCR 방법을 이용하여 유전자 전사체의 발현을 조사한 결과 ADAM-8, -12, 그리고 -17은 oil을 주사하거나 P4만을 주사한 군보다 E2를 주사한 군에서 자궁조직에서의 mRNA의 양이 현저하게 증가하였다. 반면 ADAM-9, -10, -15, 그리고 ADAMTS-1은 oil을 주사하거나 E2만을 주사한 군보다 P4를 주사한 군에서 mRNA의 양이 현저하게 증가하였다. 또한 단백질의 발현양상의 결과도 RT-PCR의 결과와 동일하게 관찰되었다. 이러한 결과로 미루어 ADAM-8, -12, 그리고 -17은 17β-estradiol에 의하여, ADAM-9, -10, -15, 그리고 ADAMTS-1은 progesterone에 의하여 유전자의 발현이 upregulation 되는 것으로 생각되어진다.
임신한 생쥐 자궁조직에서의 ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, 그리고 ADAMTS-1의 유전자 및 단백질의 발현 양상을 RT-PCR, immunoblotting 그리고 immunohistochemistry 방법을 이용하여 알아본 결과, 조사된 ADAM 종류와 임신 날짜별로 다르게 나타났다. ADAM-8의 유전자 전사체는 임신 1일째 매우 강하게 발현되었으나 임신 3일째로 진행되면서 감소하다가 이후 다시 임신 5일째가 되면서 증가하는 양상을 보였다. ADAM-9, -10, -17, 그리고 ADAMTS-1의 경우는 임신 1일째에서 5일째까지 유전자의 발현 양상이 크게 변하지 않았고 ADAM-12와 ADAM-15의 유전자 전사체는 임신 1일에서 5일로 진행되면서 현저하게 증가되는 양상을 보였다. 이후 임신 6일에서 8일에서는 생쥐 배아가 착상된 부위와 비착상부위로 나누어 유전자의 발현양상을 관찰한 결과, 조사된 ADAM 모두 비착상 부위보다 착상부위에서 유전자 전사체의 발현이 크게 증가되는 것으로 나타났다. 초기 임신기간 동안의 단백질의 발현에 있어서는 ADAM-8을 제외한 나머지 ADAM의 경우, 임신 1일에서 5일로 진행됨에 따라 단백질의 발현이 크게 증가하였으며 임신 6일에서 8일째에서는 조사된 모든 ADAM의 단백질이 비착상부위보다 착상부위에서 현저하게 많이 발현되는 것으로 관찰되었다. 또한 이들 단백질의 공간적인 발현양상을 조사한 결과 주로 luminal epithelium과 glandular epithelium에 분포하는 것으로 나타났으며 immunoblotting 결과와 동일한 발현 양상이 관찰되었다.
자궁조직에 생쥐 배아가 착상하기 위해서 배아는 우선 자궁 내막조직에 접착 (attachment) 되고 이후 뚫고 들어가야 한다. 착상시기 동안 자궁 내막조직에 발현된 ADAM의 역할을 알아보기 위하여 각 ADAM에 대한 특이한 항체를 이용, ADAM의 기능을 blocking 하였다. 착상이 일어나기 직전에 생쥐의 자궁 내강 안으로 ADAM-8, -10, -12, -15, -17, 혹은 ADAMTS-1에 대한 항체를 주입한 후 자궁 조직에 착상되는 배아의 수를 조사한 결과, 0.9% NaCl을 주사한 대조군보다 모든 실험 군에서 착상된 배아의 수가 감소하였다. 이러한 결과는 ADAM은 착상이 이루어지는 초기 임신기간 동안 자궁 내막조직에서 발현되며 또한 성공적인 착상과정이 이루어지는데 있어서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
위의 모든 결과를 종합하여 보면, 생쥐 자궁조직에서 ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, 그리고 ADAMTS-1은 생식 주기와 초기 임신 시기별로 서로 다르게 발현이 조절되며, 또한 자궁내막 조직의 재구성과 초기 임신 시기의 배아의 착상과정에 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In mammals, the uterus of a mature female undergoes a cyclic alternation. This is a steroid-driven event called the estrous cycle in rodents, reflecting the cyclic changes of the uterine endometrium in preparation for embryo implantation. ADAMs (a disintegrin and metalloprotease) are a novel family of proteins containing disintegrin and metalloprotease domain, which have been implicated in cell adhesion via integrin binding and shedding of membrane bound proproteins, signaling receptors, and adhesion molecules possessing a protease activity. Despite over 30 ADAMs have been identified to date, only a few have been known to work biological functions, in particular, in reproductive organs. The present study aimed to investigate if ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS (a disntegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs) -1 might be involved in remodeling process of mouse uterus during estrous cycle and implantation in early pregnancy.
Messenger RNA expression of these ADAM genes was observed to occur in all uterine tissues examined regardless of cycling stage. However, level of ADAM-8 mRNA was maximal at proestrus while that of ADAM-9 and ADAMTS-1 mRNAs was maximal at estrus. Minimum mRNA level of these genes was always observed at diestrus. mRNA level of other genes was not significantly different among the different estrous stage. Immunoblot analyses demonstrated the presence of proteins of all ADAM genes examined but the amount of each ADAM protein varied depending on the estrous stage of uterus. Immunohistochemical staining of uterine tissues with antibodies against ADAM-8, -12, and -17 showed the least intensity at diestrus and the strongest intensity at proestrus. Overall staining intensity of ADAM-9 protein gradually increased as cycle progressed from diestrus to estrus at which the strongest intensity was observed. The intensity of ADAM-10 and ADAMTS-1 protein was minimal at diestrus and increased as cycle progressed reaching maximal at metestrus. Staining intensity of ADAM-15 protein were noted faint at diestrus but obviously increased at proestrus and estrus. Immunohistochemical studies also showed the appearance of all ADAM proteins in both luminal and glandular epithelia and no distinct staining was observed in other areas. However, depending on the species of ADAM and on the cycling stage, large heterogeneous localization of ADAM proteins was observed. From these observations, it is suggested that ADAM genes examined in this study might play an important role in the event of uterine tissue remodeling during estrous cycle in mouse.
Effects of steroids on uterine gene and protein expression of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 were investigated in ovariectomized mice. Ovariectomized mice were injected with 17β-estradiol (E2, 300ng/mouse), progesterone (P4, 1mg/mouse), E2 plus P4, or vehicle (sesame oil), and uterine tissues were processed for RT-PCR and immunoblotting. The results of RT-PCR demonstrated that uterine levels of ADAM-8, -12 and -17 mRNAs were increased by E2, and these responses were much higher when compared to P4 or vehicle. In contrast, administration of P4 to ovariectomized mice markedly stimulated the expression of ADAM-9, -10, -15 and ADAMTS-1 mRNAs, whereas injection of E2 alone to ovariectomized mice did not stimulate their expression. By using polyclonal antibodies raised against mouse ADAM proteins, it was shown that E2 or E2+P4 treatment after ovariectomy gave strong signals of ADAM-8, -12, and -17 proteins but P4 or vehicle treatment resulted in weak signals. In contrast, levels of protein expression of ADAM-9, -10, -15, and ADAMTS-1 were significantly increased after P4 or E2+P4 treatment, but E2 or vehicle treatment did not induce protein signals. These results indicate that gene expression of the ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 could be regulated by ovarian steroids in mouse uterus: gene expression of ADAM-8, -12, and, -17 is upregulated by E2 and that of ADAM-9, -10, -15, and ADAMTS-1 is upregulated by P4.
Results of RT-PCR, immunoblotting, and immunohistochemistry also showed the differential expression of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 genes in mouse uterus during early pregnancy. During days 1-5 of pregnancy, mRNA levels of ADAM-8 were the highest at day 1, then decreased to day 3, and gradually increased to day 5. Messenger RNA expressions of ADAM-9, -10, -17, and ADAMTS-1 were not significantly changed while those of ADAM-12 and ADAM-15 showed distinct rising pattern from day 1 to day 5 of pregnancy. On days 6-8 of pregnancy, the mRNA levels in the implantation sites were much higher than those in the interimplantation sites. Immunoblot analyses demonstrated the appearance of all ADAM proteins examined in both luminal and glandular epithelia. However, the staining intensity of uterine tissues with antibodies raised against each ADAM protein species varied depending on the duration of pregnancy. From day 1 to day 5, protein signals of ADAMs significantly increased except for ADAM-8. The staining intensity of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 proteins was much higher in implantation sites than that of interimplantation site during days 6-8 of pregnancy. Immunohistochemical analyses showed the appearance of all ADAM proteins mainly in luminal and glandular epithelium. Expression of ADAM-9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 proteins except for ADAM-8 overall increased in the uterus during days 1 to day 5 of pregnancy, but the staining intensity was significantly higher in implantation area compared to interimplantation area during days 6-8 of pregnancy.
For implantation and placentation to occur, trophoblastic cells of mouse embryos must attach and penetrate the uterine stroma to make contact with maternal blood vessels. To investigate the role of endometrial ADAMs during implantation, effect of antibodies on the function of ADAM was examined using in vivo mouse model. Functional blockade of ADAM-8, -10, -12, -15, -17 or ADAMTS-1 proteins was made on the day of implantation by intrauterine injection of polyclonal antibodies against mouse each ADAM protein resulted in the reduction of the number of implantation sites when compared to the control receiving 0.9% NaCl. These results demonstrate that the murine ADAMs examined in this study are expressed in the uterine endometrium at the time of implantation and might play roles in a cascade of events leading to successful implantation.
Upon all results mentioned, differential expression and regulation of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 genes in mouse uterus suggest important roles in the remodeling of uterine tissues during estrous cycle and implantation process.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT = i
• CONTENTS = v
• LIST OF FIGURES = vii
• LIST OF TABLES = ix
• INTRODUCTION = 1
• MATERIALS AND METHODS = 11
• 1. Animals = 11
• 2. Total RNA isolation and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) = 11
• 3. Immunoblotting = 13
• 4. Immunohistochemistry = 15
• 5. Ovariectomy and hormone treatment of mice = 16
• 6. In vivo intrauterine antibody injection experiments = 16
• 7. Chemicals = 17
• 8. Statistical analysis = 17
• RESULTS = 18
• 1. Expression of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 in mouse uterine tissue during estrous cycle = 18
• 2. Effects of 17β-estradiol and progesterone on uterine gene expression of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 in ovariectomized
• mice = 22
• 3. Expression of ADAM-8, -9, -10, -12, -15, -17, and ADAMTS-1 in mouse uterine tissue during days 1-8 of pregnancy = 26
• 4. In vivo intrauterine antibody injection studies = 33
• DISCUSSION = 80
• REFERENCES = 97
• 국문요약 = 120