옥수수(Zea mays) nitrilases의 시간적,공간적 분포 양상과 벼(Oryza sativa) 뿌리 발달에 대한 유전적 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Root development is essential for the survival of plants. However, little information is available on root development, especially in monocot plants including rice (Orysa sativa) and maize (Zea mays). Therefore, I scrutinized the architecture of rice roots and their responses to exogenously applied auxin-related chemicals. Because it was reported that melatonin and serotonin showed auxin effects in some plants, I tested the effect of melatonin and serotonin on rice root development, and observed no effect of the substances on the roots. In contrast, indole-3-acetonitrile (IAN), the substrate of nitrilases for auxin biosynthesis, revealed clear inhibitory effects on the elongation of the primary root, as 1-naphthaleneacetic acid (1-NAA), an artificial auxin, did. I also carried out mutant screening with a subset, i. e.,300 lines, of Ds-tagged population that was tagged with a transposable element As a result, mutant candidates possessing abnormal phenotypes in the primary- or crown-roots were selected, and some of them were cultivated for propagation on a test field of the Rural Developmental Administration located in Mil-yang. The adult plants displayed abnormal phnotypes; e.g., dark green leaves and no fruits. For the isolation ofdifferentially expressed RNAs between the primary- and the crown-root of rice, it was used that the Gene FishingTM DEG Discovery Service program (Seegene), using a series of random primers. The DEG detected 6 and 3 products that were specifically expressed in the primary root or in the crown-root, respsctively. Among them, I selected the most prominent three PCR products, and got sequence and the partial clones. So, we have three kind of root-type specific gene candidates. However, the Blast search did not reveal any function of the transcripts. I also studied about the distribution of nitrilase transcripts in the roots of maize by RT-PCR and in situ analysis. Using in situ techniques, the transcripts of ZmNIT2 was observed in pericycle and around of xylems. The range of nitrilase2 signal became narrower and concentrated to the tips in the primary root from 2 to 4 days after germination. However, no specific tissue specificity of ZmNIT2 was observed in the coleoptilar node.

국문 초록 (Abstract)

세계적인 작물인 벼와 옥수수는 모두 외떡잎 식물이다. 하지만 대부분의 식물의 뿌리에 대한 연구는 Arabidopsis를 비롯한 쌍떡잎 식물에서 이루어졌다. 또한 뿌리는 식물체의 생명유지에 절대적으로 필요하지만, 지하부에 존재하기 때문에 연구 대상으로 기피되었다. 따라서 뿌리의 형태 관찰부터 시작하여 식물 생장과 발달에 중요한 영향을 미치는 호르몬 중 하나인 auxin관련 물질을 처리하여 그 표현형의 변화를 살펴보았다. nitrilases의 기질로 알려진 IAN (indole-3-acetonitrile)과 인공 auxin으로 알려진 1-NAA를 처리하였을 때 뿌리의 생장이 저해되었으며, 일부식물체에서 auxin 효과를 일으킨다고 알려진 melatonin과 serotonin의 경우, 벼와 옥수수 뿌리에서는 별 효과를 일으키지 않았다. 또한 Ac-Ds 전이인자를 삽입하여 돌연변이를 유발시킨 볍씨를 확보하여, 돌연변이체를 선별하는 작업을 수행하였다. 이 과정에서 줄기의 굴중성 이상, 잎의 색소 이상, primary root의 길이생장 이상, crown root의 길이생장 이상 등 여러 가지 돌연변이 후보군의 표현형을 관찰하였으며, 이 중 뿌리 발달과 연관성이 있는 돌연변이 후보군만을 선별하였다. 이 중 뚜렷한 표현형을 가진 돌연변이 후보군을 밀양의 영남시험장에 의뢰하여 성체가 될 때까지 키웠으며, 성체가 된 돌연변이 후보군은 잎의 색깔이 검게 변하였고, 열매를 맺지 못하는 표현형을 가지고 있었다. 또한 옥수수에서 auxin 생합성 과정의 마지막 단계에 관여하는 nitrilase의 분포에 대하여 조사하였다. 옥수수 nitrilases의 기능과 역할은 이미 많은 연구가 진행되어 있었으나, nitirlases의 발달 시간별 그리고 조직 특이적으로 발현되는 양상은 보고된 바가 없었다. 먼저 RT-PCR을 통해 nitrilase 1은 발현되지 않으며, nitrilase 2는 shoot에서 보다 뿌리에서 강하게 발현되고 있음을 확인하였다. 또한 빛이 있는 조건과 빛이 없는 조건에서 3일과 4일 동안 키운 옥수수 뿌리 끝을 이용한 RT-PCR결과, nitrilase 2의 발현 패턴에는 빛이 큰 영향을 주지 않았지만, 3일보다 4일에서 강하게 발현되는 것을 볼 수 있었다. 이를 바탕으로 in situ analysis를 수행하였는데, RT-PCR 결과와는 반대로 시간이 지날수록 옥수수 뿌리 끝에서 발현되는 nitrilase 2의 범위는 줄어드는 것으로 확인되었다. 이러한 상반되는 결과는 RT-PCR 수행시 너무 많은 cycle을 반복하여 RNA의 미세한 발현량 차이를 측정하기에는 부적합하므로, in situ analysis의 결과가 실제의 nitrilase 2의 분포 양상을 보여주는 것으로 생각된다. 또한 옥수수 뿌리 끝 부분을 가로로 잘랐을 때, 물관부 주변과 pericycle 세포층에서 nitrilase 2가 발현되는 현상도 관찰하였다. Nitrilases 돌연변이체를 이용해 nitrilases의 분포를 조사하였는데, nitrilase 1의 돌연변이체의 경우 nitrilase 2의 발현만 탐지 되었고, nitrilase 2 돌연변이체의 경우 nitirlase 1의 발현양은 자연형보다 많아진 것 같지만 nitrilase 2의 발현은 나타나지 않았다. 자연형과는 다르게 node의 뿌리부분에서 nit1/NIT2 돌연변이체는 nitrilase 2가 좀 더 높게 발현되는 것을 확인하였고, NIT1/nit2의 경우 nitrilase1이 강하게 발현되었다. 식물체 내의 뿌리에서 발달하는 lateral root의 시작 부분과 node의 crown root 형성 과정을 포착하여 nitrilases의 시간적 공간적 분포에 대한 연구를 더욱 진행하여야 할 것이다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 6
• 1. 실험 재료 = 6
• 2. Mutant screening = 6
• 3. Auxin 관련 시약 처리에 따른 벼 뿌리의 표현형 관찰 = 7
• 1) Auxin 관련 시약 처리 = 7
• 2) Melatonin 처리 = 7
• 3) Serotonin 처리 = 7
• 4. DEG Discovery system (Seegene)에 의한 뿌리형 특이적인 전사체 검사 = 7
• 1) 벼 뿌리 종류 별 total Rna 추출 = 7
• 2) GeneFishing＾(TM) DEG Discovery Service (seegene) = 8
• 5. 옥수수 Nitrilases RT-PCR = 8
• 1) 옥수수 Total RNA 추출 = 8
• 2) RT-PCR = 9
• 6. Nitrilases partial cloning = 9
• 1) Nitrilases partial cloning = 9
• 2) Plasmid DNA 분리 및 insert확인 = 10
• 7. In situ analysis = 11
• 1) Dig labeling RNA in situ probe 제작 = 11
• (1) Plasmid lineraized 과정 = 11
• (2) In vitro transcription 과정 = 11
• (3) Dig labeling RNA probe checking 과정 = 11
• 2) 옥수수 tissue에 paraplast embedding 과정 = 12
• 3) 각 부분 별 옥수수 tissue sectioning 과정 = 13
• 4) Paraplast를 제거해주는 전처리 과정 = 13
• 5) Dig labeling in situ RNA probe hybridization 과정 = 14
• 6) Washing 과정 = 14
• 7) Dig antibody를 이용한 detection 과정 = 14
• Ⅲ. 결과 = 16
• 1. Mutant screening을 통한 돌연변이 후보군 발견 = 16
• 2. Auxin 관련 물질 처리에 따른 외떡잎 식물의 뿌리 표현형 변화 관찰 = 16
• 3. 뿌리 종류에 따라 특이적으로 발현하는 유전자 탐색 = 17
• 4. 옥수수 유식물의 각 부위 및 발달 시간 별 nitrilases 전사체 분포 조사 = 17
• 5. Nitrilases Partial clone 제작 = 18
• 6. Nitrilases 탐침 제작 = 18
• 7. Nitrilases 분포의 조직 특이성 검증 (공간적 분포 조사) = 18
• 8. 옥수수 생장에 따른 nitrilases 분포의 변화 검증 (시간적 분포 조사) = 19
• 9. 옥수수의 nitrilases mutants에서 nitrilases의 in situ 분석 = 19
• Ⅳ. Figures = 22
• Ⅴ. 고찰 = 35
• Ⅵ. 참고문헌 = 39
• Ⅶ. List of Tables = 42
• Ⅷ. List of Figures = 43
• Ⅸ. Abstract = 44