Identification of Nuclear Localization Signal in Human Nanog

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Nanog is a homeobox-containing transcriptional factor required for maintaining the pluripotent state of stem cells. We investigated the nuclear localization signal (NLS) motif required for human Nanog (hNanog) nuclear import. Mutation analysis revealed that a mutant containing only the homeodomain (HD) was exclusively localized to the nucleus, while other mutants containing either the N- or C-terminal region (NR or CR) had impaired nuclear localization. In addition, NR and CR were exclusively localized to the nucleus when they were fused to the HD, indicating that complete nuclear localization is only driven by functional NLS motif(s) within the HD. Furthermore, partial loss of HD led to the incomplete localization of hNanog, suggesting that the intact HD is required for hNanog nuclear import. A series of deletion and site-directed mutagenesis within the HD revealed that two basic NLS motifs are located at the N-terminus and C-terminus of the HD and that both motifs are required for complete hNanog nuclear localization.

국문 초록 (Abstract)

Nanog는 homeodomain protein으로서 배아줄기세포 (Embryonic stem cell)의 자가 재생산 (Self-renewal)과 다능성 (Pluripotency)을 유지하는데 중요한 전사인자 (Transcription factor)이다. Human Nanog (hNanog)는 305개의 아미노산(Amino acid)로 구성되어 있으며, mouse Nanog (mNanog)의 Open Reading Frame과 homeodomain의 아미노산 서열이 각각 58%, 80%의 유사성이 있다. 그러나 hNanog의 기능적인 도메인 (Domain)과 분자생물학적 기전에 대해서는 아직까지 알려진 부분이 많지 않다. 우리는 hNanog가 핵 속으로 유입되기 위해 필요한 nuclear localization signal (NLS) motif에 대해 조사하였다. hNanog의 homeodomain, N-terminal region, C-terminal region을 EGFP와 fusion protein을 만들어 COS-7 cell에 transfection 후 localization을 확인한 결과, N- 또는 C-terminal region 만을 포함하는 경우 각각 핵과 세포질 또는 세포질에서만 EGFP가 발현하는 반면, homeodomain만을 포함한 fusion protein은 핵 안에서 강하게 발현하는 것으로 보아 hNanog의 NLS motif가 homeodomain 안에 존재하는 것으로 추정되었다. 또한 homeodomain을 N- 또는 C-terminal region과 fusion 시켰을 때에도 핵에서 EGFP가 강하게 발현하는 것으로 다시 한번 NLS motif가 homeodomain에 존재하는 것을 확인하였다. 게다가 homeodomain 내 존재하는 NLS motif를 찾기 위해 deletion mapping과 site-directed mutagenesis 결과, hNanog의 homeodomain 내 N- 과 C-terminal NLS motif가 존재하는 것을 확인하였고, N-terminal NLS motif가 C-terminal NLS motif 보다 좀 더 강하게 작용하는 것을 확인하였다. 또한 hNanog가 핵 속으로 유입되기 위해 두 NLS motif가 모두 필요하며 손상되지 않은 전체의 homeodomain이 필요한 것을 확인하였다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. INTRODUCTION 1
• Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 4
• Ⅱ. 1. Plasmid constructs 4
• Ⅱ. 2. Cell culture and transient transfection 4
• Ⅲ. RESULTS 7
• Ⅲ. 1. Subcellular localization of hNanog wild-type and deletion mutants fused to EGFP 7
• Ⅲ. 2. An intact homeodomain is required for complete hNanog nuclear localization 11
• Ⅳ. DISCUSSION 15
• REFERENCES 17
• SUMMARY IN KOREAN 20