배유특이 promoters를 이용한 serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase 유전자 발현 형질전환 벼 = Ectopic expression of serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase gene by endosperm specific promoters in rice

국문 초록 (Abstract)

Serotonin N-hydroxycinnamoyltransferase(SHT)는 cinnamoyl CoA-유도체와 serotonin을 기질로 하여 항산화 물질인 4-coumaroylserotonin, feruloylserotoin 등과 같은 serotonin 유도체의 생합성을 촉매 하는 효소이다. 기존 육성한 ubiquitin promoter를 이용한 형질전환 벼 보다 더 많은 량의 serotonin 유도체를 종자에 축적시키기 위해 벼 배유특이 promoters인 glutelin과 prolamin promoter를 이용하여 SHT유전자가 벼 종자에만 발현 하도록 형질전환체를 생산하였다. Southern, Northern, Western blot 등 몇몇의 분자 생물학적인 실험들을 통하여 배유특이 promoters인 glutelinA3와 prolamin promoters를 이용하였을 때 SHT 유전자가 종자에서 어느 정도 발현하는 것을 확인하였지만 이러한 발현이 종자 내로의 serotonin유도체 축적에는 큰 영향을 주지 못함을 확인하였다. 벼 종자의 serotonin 유도체의 함량을 분석하던 중 우리는 HPLC chromatogram에서 16분대에 wild type에서는 아주 미약한 peak가 형질전환 벼에서는 보다 높게 나타남을 확인하였다. 이 시간대에 상응하는 standard가 없었기 때문에 이 peak의 area만을 확인해 본 결과 형질 전환 벼에서 적게는 3배에서 많게는 7배 정도 wilde type보다 높음을 확인하였다. 이는 알지 못하지만 종자에만 존재하는 어떠한 기질이 형질전환 벼에서 발현 되어진 SHT에 의해 미지의 serotonin 유도체를 생산해 냈을 것으로 추정된다.
배유특이 promoters의 이용은 ubiquitin이나 35S promoter를 이용 시 serotonin 유도체 화합물이 식물체의 전반적인 조직에 과다 발현, 축적될 경우 식물의 생육을 저해할 수 있는 상황으로부터 보호하고 이러한 물질이 배유특이 promoter를 사용함으로서 종자 배유부위에만 발현케 하여 주식으로 사용하는 백미에 영양약리물질을 높은 농도로 함유하는 종자 생산을 가능하게 할 것이다.

목차 (Table of Contents)

• 초 록 1
• 서 언 3
• 재료 및 방법
• 1. 벼 형질전환용 vector 재조합6
• 2. 벼 형질전환을 위한 callus 유도9
• 3. 벼 형질전환 및 재 분화9
• 4. Genomic DNA 분리 및 Southern 분석10
• 5. Total RNA 분리 및 reverse transcriptase PCR, Northern 분석 11
• 6. Western 분석12
• 7. SHT 효소 활성 측정12
• 8. 종자 내 serotonin 유도체 함량 분석13
• 결 과
• 1. 형질전환체 획득 14
• 2. Southern blot 분석14
• 3. GlutelinA3:SHT 발현 형질전환 벼 종자의 SHT 효소 활성 측정 및 Western blot 분석16
• 4. GlutelinA3:SHT 발현 형질전환 벼 종자의 total RNA RT-PCR18
• 5. GlutelinA3:SHT 발현 형질전환 벼 종자의 serotonin 유도체 함량분석20
• 6. Prolamin:SHT 발현 형질전환 벼 종자의 Western blot 분석 및 SHT 효소 활성 측정22
• 7. Prolamin:SHT 발현 형질전환 벼 종자의 Northern blot 분석24
• 8. Prolamin:SHT 발현 형질전환 벼 종자의 serotonin 유도체 함량 분석25
• 9. 형질전환 벼 종자에서 HPLC chromatogram 상의 미지의 화합물 peak27
• 고 찰29
• 인용 문헌31
• Abstract 34