Effects of soybean endophytes on plant abiotic stress = 식물 비생물학적 스트레스에 대한 콩 내생균의 효과

국문 초록 (Abstract)

기후변화는 각종 작물의 재배한계선을 북상시키는 등 식물 생태계에 큰 영향을 미치고 있다. 최근 전 세계에는 가뭄과 홍수, 해수면 상승 등 자연재해가 발생하여 작물의 수확량이 급감하는 사례가 늘고 있으며 이미 기후변화에 따른 식량위기가 시작됐다는 경고도 나오고 있다. 5대 주요 작물(쌀, 밀, 옥수수, 보리, 대두) 중에 하나인 대두는 순식용으로 소비되어 인류의 단백질 공급원이 되기도 하고, 식품가공을 주로 하는 가공 원료로 쓰이기도 하며, 대두박의 형태로 가축의 배합사료로 사용된다. 식물내생균(endophyte)는 식물조직내 살고 있으며, 기주 식물(host plant)에 위해를 가하지 않는 미생물이다. 내생균은 숙주식물로부터 광합성 산물을 흡수할 뿐만 아니라 이차대사산물을 분비함으로써 식물에게 다양한 이득을 제공하는 상리공생관계로 알려져 있다. 이러한 상호작용의 종류에는 환경조건이나 식물과 내생균의 관계에 따른 비생물학적 요인(abiotic stress)과 생물학적 요인(biotic stress)들에 의해서 결정이 되어진다. 본 연구에서는 대두에서 분리한 내생균을 이용한 비생물학적(abiotic stress) 스트레스 완화 기작에 관한 연구이다. 우선 대두식물와 대두식물이 자란 토양에서의 다양한 미생물 배지를 통한 내생균을 순수 분리하였고, 세균은 16S rRNA 영역과 진균은 ITS영역의 염기서열 분석으로 미생물 동정을 수행하였다. 그 결과 Flavobacterium 속에 해당하는 균주들이 대두식물 조직(내생균)과 토양시료 등에서 다수 발견이 되었다. 본 연구에서 식물조직안에서 발견된 4개 균주들 Flavobacterium sp. PN4, Flavobacterium sp. BB8, Flavobacterium sp. AG3, 그리고 Flavobacterium sp. AG4에 의한 비생물학적 환경스트레스(저온, 염해, 가뭄)에 대한 작용기작연구를 수행하였다.
먼저, 분리된 4개의 균주들의 식물생장효과가 있는지 확인하기 위해 모델 식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana) 식물과 내생균의 공동배양을 통하여 식물생장효과(잎 무게, 잎의 수, 뿌리길이, 뿌리 무게, 엽록소)를 확인하였다. 뿌리길이를 제외한 잎 무게, 잎의 수, 뿌리 무게, 엽록소 함량이 대조군에 대해서 현저히 상승되었음을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 결과는 균주 PN4 보다 BB8, AG3, and AG4에서 그 효과가 두드러짐을 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 저온(cold, 15oC), 염해(100mM NaCl), 가뭄(0.5~4% PEG)에서 내생균의 효과를 관찰하였다. 그 결과 4개의 균주는 저온, 염해, 가뭄 모든 환경스트레스에서 유사한 결과를 나타내었다. 특히 PN4 균주는 다른 3개의 균주(BB8, AG3, AG4)에 비해 세균의 색소(pigment)에 차이가 있음을 관찰하였고, 이러한 사실을 바탕으로 세균의 전장유전체(whole-genome sequencing) 시퀀싱을 수행하였고 유전체로부터 카로티노이드(carotenoid) 생산 클러스터(cluster)를 확인할 수 있었다. 또한 HPLC 분석을 통하여 4개의 균주는 β-carotene과 zeaxanthin을 생성함을 확인하였다. 특히, PN4균주는 다른 3개의 균주 (BB8, AG3, AG4) 보다 β-carotene과 Zeaxanthin의 생성량이 10배 가량 감소되어 있음을 정량적으로 확인하였다. 이러한 결과는 BB8, AG3 그리고 AG4가 생산하는 β-carotene과 Zeaxanthin 생산량이 식물의 비생물학적 스트레스 완화효과와 관련이 있음을 확인할 수 있었다. 추가적으로 해당 균주 처리 후 식물에서의 항산화능을 확인하였고, 특히 3개의 균주(BB8, AG3, AG4) 처리 후 식물에서의 항산화능(CAT, APX, POD)이 대조군에 비해 현저히 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 대두식물에서 분리한 내생균 PN4, BB8, AG3 그리고 AG4는 β-carotene과 Zeaxanthin의 생산을 통하여 식물의 비생물학적 스트레스를 완화시켜줌을 확인할 수 있었다. 본 연구를 통하여 기후변화 대응 생태복원 기술연구 뿐만 아니라 작물생산성 증대를 위한 친환경 바이오소재로 활용 가능할 것이다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The predominant signs of climate change are elevated mean surface temperature, ice melting, sea level rise, and extreme weather events. As a result of these rapid global alterations, crops are increasingly facing abiotic stresses. Chilling, drought, and salinity are major abiotic stresses that cause changes in physiological, biochemical, and molecular processes in plants, resulting in significant productivity losses in crops. Climate change has already affected food security in many parts of the world. To increase agricultural production, chemicals have been used; however, the excessive use of such chemicals has become a severe threat to human health and the environment. An alternative, environmentally friendly approach is to use beneficial microorganisms to increase crop yield under abiotic stress conditions. These microbes enhance plant growth through various mechanisms such as phytohormone production, ACC deaminase, phosphate solubilization, siderophore production, antioxidant defense system, and other metabolites in plants. This research aims to improve the effect of plant growth-promoting bacteria (PGPB) on plants under the abiotic stresses associated with global climate change. First, endophytes were isolated and identified from soybean (Glycine max L.cv. Gwangan) and soil where soybean grew. It was found that the major genus of soybean endophytes was Flavobacterium. The discovered Flavobacterium isolates were named PN4, BB8, AG3, and AG4. Research was performed to characterize plant growth-promoting effects under abiotic stress (chilling, salinity, drought) conditions. To confirm the plant growth effect under general conditions, PN4, BB8, AG3, and AG4 were applied to Arabidopsis thaliana. The growth promotion effect was confirmed in the root length, the weight of the root, the number of leaves, leaf weight, and chlorophyll contents. The effects of BB8, AG3, and AG4 were more prominent than those of PN4. Subsequently, the experiment was conducted under abiotic stresses such as chilling (15oC), salinity (100 mM NaCl), and drought (0.5-4% PEG). The growth-promoting effect of the tested endophytes was confirmed under all abiotic stress conditions. Notably, strain PN4 had a different pigment compared with strains BB8, AG3, and AG4. Based on this finding, whole-genome sequencing of the bacteria was conducted, and strains PN4, BB8, AG3, and AG4 were found to contain carotenoid-producing clusters. Furthermore HPLC analysis confirmed that strains PN4, BB8, AG3, and AG4 produced β-carotene and zeaxanthin. Notably, strain PN4 produced 10 times less β-carotene and zeaxanthin compared with strains BB8, AG3, and AG4. This means the production of β-carotene and zeaxanthin by strains PN4, BB8, AG3, and AG4 was related to improving the abiotic stress of plants. After the treatment of Flavobacterium spp., it was discovered that the strains PN4, BB8, AG3, and AG4 showed antioxidant activity in the plant. Among the treatment of Flavobacterium spp., the antioxidant activities (CAT, APX, POD) of strains BB8, AG3, and AG4 were significantly increased compared with those of the control. These results showed that the endophytes PN4, BB8, AG3, and AG4 isolated from soybean plants improved the abiotic stress of plants through the production of β-carotene and zeaxanthin. This study demonstrates that it will be possible to use strains PN4, BB8, AG3, and AG4 as an eco-friendly biostimulant to increase crop productivity as well as conduct research on ecological restoration technology in response to climate change.

목차 (Table of Contents)

• CONTENTS ⅰ
• LIST OF FIGURES ⅳ
• LIST OF TABLES ⅵ
• ABSTRACT 1
• 1. INTRODUCTION 4
• 2. MATERIALS AND METHODS 7
• A. Isolation and identification of endophytes from soybean (Glycine max L.cv. Gwangan) 7
• B. Functional studies of Flavobacterium spp. 8
• 1) Plant growth-promoting (PGP) assay 8
• 2) Plant growth-promoting assays under abiotic stresses 12
• a) Plant growth-promoting assay under chilling stress 12
• b) Plant growth-promoting assay under salinity stress 12
• c) Plant growth-promoting assay under drought stress 13
• C. Functional study of Flavobacterium spp. under chilling stress 13
• 1) Functional study of Flavobacterium spp. 13
• a) Enzymatic assay 14
• b) The pigment of Flavobacterium spp. 16
• c) Gene cluster analysis using whole genome sequence data 16
• d) Functional substance analysis using high-performance liquid chromatography (HPLC) 18
• 2) Antioxidant activity of Flavobacterium spp. 21
• 3. RESULTS 24
• A. Isolation and identification of endophytes from soybean (Glycine max L.cv. Gwangan) 24
• B. Functional studies with Flavobacterium spp. 31
• 1) Plant growth-promoting assay 31
• 2) Plant growth-promoting assay under abiotic stresses 36
• a) Plant growth-promoting assay under chilling stress 36
• b) Plant growth-promoting assay under salinity stress 40
• c) Plant growth-promoting assay under drought stress 43
• C. Functional study of Flavobacterium spp. under chilling stress 46
• 1) Results of enzymatic assay 46
• 2) The pigment of Flavobacterium spp. 50
• 3) Gene cluster analysis using the whole-genome sequence data 52
• a) Gene cluster analysis 52
• b) RAST analysis 54
• c) KEGG pathway analysis 56
• 4) HPLC analysis 58
• D. Antioxidant activity of Flavobacterium spp. under chilling stress 63
• 1) Results of ROS-staining under the chilling stress 63
• 2) Antioxidant activity of PN4, BB8, AG3, and AG4 under the chilling condition 65
• 4. DISCUSSIONS 69
• 5. CONCLUSIONS 72
• A. Conclusion 72
• B. future plans 72
• REFERENCES 73
• ABSTRACT IN KOREAN 80
• ACKNOWLEDGEMENTS 83