계대 배양에 따른 성인 중간엽 줄기세포의 특성 변화 및 단백질 분석 = Proteome analysis and the characteristics of human mesenchymal stem cells during serial subculture

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) can be induced to differentiate into a variety of tissues, including bone, cartilage, fat, and muscle, in vitro and in vivo. Autologous MSCs have several advantages over embryonic stem (ES) cells: there is no teratocarcinoma formation, no immune rejection, and there are no ethical problems. Compared with ES cells, however, MSCs have very poor replicative capacity and short proliferative longevity. Therefore, an important challenge in regenerative medicine is to improve the replicative capacity of MSCs, in order to obtain sufficient MSCs to repair large defects. A few studies have reported the effect of donor variation (age, gender, subculture, and so on) on the isolation, expansion and characterization of MSCs. Of these, the effects of extensive subculture on the proliferation and the osteogenic potential of MSCs remain controversial. The goal of our study was to characterize the proliferation and the osteogenic potential of human MSCs during serial subculture and to identify differentially regulated proteins in human MSCs during serial subculture and the osteogenic differentiation using proteome analysis. Human bone marrow-derived MSCs were serially subcultured and maintained in basal or osteogenic medium for 14 days. The human MSCs had different morphologies, immunophenotypes, and growth rates that were correlated with the length of serial subculture. The phenotype changed from small spindle-shaped cells at passage 1 into large cuboidal or flattened cells at passage 7. The osteogenic capacity of human MSCs decreased during serial subculture. Using RT-PCR, the mRNA levels of bone-specific genes, such as cbfa1runx2 and osteocalcin, decreased with increasing passage number. Strong positive staining was observed for ALP and Alizarin red s in osteogenic medium on day 14, but declined significantly with increasing passage numbers. Furthermore, depositions of calcification were observed in osteogenic medium on day 14, but declined significantly with increasing passage number. During the serial subculture of human MSCs, proteome analysis, RT-PCR, and western blotting were used to identify differentially regulated proteins that affect the proliferation and osteogenic potential of MSCs. The MSCs showed differentially regulated expression of protein species during serial subculture. Of the proteins identified using peptide mass fingerprinting, 8 were up-regulated and 4 were down-regulated. Of the differentially regulated proteins, Annexin A1, Cathepsin D, TCP-1a, and CCTr were associated with cell proliferation, the cell cycle, morphology, and apoptosis. In RT-PCR and western blotting, TCP-1α gradually decreased during serial subculture and the osteogenic differentiation. In this study, we showed that the proliferation and osteogenic capacity of human MSCs decreased during serial subculture; of the proteins differentially regulated during serial subculture, TCP-1α may affect proliferation and osteogenic differentiation of human MSCs.

국문 초록 (Abstract)

골아세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포 등으로 분화가 가능한 중간엽 줄기세포는 자가이식이 가능하여 면역학적 문제가 적고, 골수처럼 이미 성장한 신체조직에서 추출하여 이용하기 때문에 윤리적 논쟁을 피할 수 있다. 또한, 실제 임상에서 필요로 하는 조직의 재생을 가능하게 할 뿐 아니라, 이식 후 각 조직의 특성에 맞게 분화할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 조직 재생이나 치료에 적용할 만큼 충분한 양의 중간엽 줄기세포를 확보하는 것이 어렵다는 단점도 있다. 이런 중간엽 줄기세포의 증식과 분화능 등은 연령, 성별, 그리고 계대 배양 정도 등 다양한 인자들에 의해 영향을 받는다고 알려져 있다. 그 중 계대 배양에 따른 중간엽 줄기세포의 증식 및 분화능에 관한 몇몇 연구 보고가 있으나, 계대 배양에 따른 단백질 변화에 관한 연구는 거의 없다. 따라서 본 연구에서는 반복적인 계대 배양에 의해 중간엽 줄기세포의 증식 및 골아세포로의 분화능이 영향을 받는지 확인하고자 하였으며, 계대 배양에 의한 단백질 변화를 확인하고, 그 중 중간엽 줄기세포의 증식 및 분화능 등에 영향을 미치는 단백질을 밝히고자 하였다. 계대 배양에 따른 중간엽 줄기세포의 특성 변화를 확인하기 위해 유세포 분석, 증식률 검사 등을 시행한 결과, 배양 초기에는 섬유모세포와 유사한 길쭉한 형태의 중간엽 줄기세포가 계대 배양에 의해 넓적한 형태로 바뀌었다. 그리고 배양 초기에는 크기가 작고 과립이 적은 중간엽 줄기세포가 계대 배양에 의해 크기도 커지고 과립도 점차 많아졌다. 또한 계대 배양에 의해 중간엽 줄기세포의 특이적 항원의 발현이 감소하였고, 증식률도 점차 감소하였다. 계대 배양에 따른 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화능을 확인하기 위해 역전사-중합효소 연쇄반응, ALP 활성도 검사, 특이염색, 칼슘 침착량 검사 등을 시행한 결과, 계대 배양에 의해 골아세포의 특이 표지자인 osteocalcin, cbfa1runx2 mRNA 발현이 점차 감소하였고, ALP 활성도 검사에서도 유의한 감소를 확인하였다. 또한 ALP와 Alizarin red 염색 정도가 계대 배양에 의해 점차 감소하는데, 특히 제 5 계대 이후 통계적으로 유의하게 감소하였다. 이를 통해 계대 배양에 의해 중간엽 줄기세포의 골아세포로의 분화능이 점차 감소하는 것을 확인하였다. 계대 배양에 따른 중간엽 줄기세포의 증식 및 골아세포로의 분화에 영향을 미치는 단백질을 확인하고자 단백질 분석을 시행한 결과, 계대 배양에 의해 중간엽 줄기세포에서 8 개의 단백질이 증가하고, 4 개의 단백질이 일정하게 감소하는 것을 확인하였다. 그 중 세포의 증식, 사멸, 세포주기 등 다양한 세포 기능에 관여한다고 보고된 바 있는 단백질들의 역전사-중합효소 연쇄반응 결과, 계대 배양에 의해 T-complex protein (TCP)-1α의 발현은 점차 감소하였으나, Cathepsin D, Annexin A1, chaperonin containing TCP1 (CCT)γ 등의 발현은 공여자에 따라 차이를 보였다. 또한, 계대 배양에 의해 점차 감소하는 TCP-1α의 발현이 골아세포로의 분화 과정에서도 역시 감소하였다. 결론적으로 중간엽 줄기세포는 계대 배양에 의해 증식 및 골아세포로의 분화능이 점차 감소하였다. 또한, 계대 배양에 의해 발현 정도가 변화한 단백질 중 TCP-1α가 계대 배양에 의해 점차 감소하였고, 골아세포로의 분화 과정에서도 역시 감소하였다. 이를 통해 TCP-1α가 중간엽 줄기세포의 증식 및 골아세포로의 분화능에 영향을 미치는 중요한 인자 중 하나일 것으로 사료되었다.