MiR-148a의 간세포 손상 및 간세포암 악성화 제어 기전

국문 초록 (Abstract)

마이크로RNA는 세포의 생존, 사멸, 재생 및 염증 반응 등을 조절하며, 이는 만성적인 간질환의 진행과 연계되어 있다. 또한 마이크로RNA의 불균형은 간세포암의 예후에 영향을 미친다. 그러나 아직까지 만성 간질환 이행과 간세포암의 악성화를 종합하는 조절자로서 마이크로RNA에 대한 연구는 부족하다. 따라서 만성 간질환과 간세포암의 악성화에 공통적으로 관여하는 신호조절자인 마이크로RNA 및 이를 매개하는 분자에 대한 연구가 필요하다.
과도한 알코올 섭취는 지방간, 간염, 간경변증 및 간세포암을 포함하는 알코올성 간질환을 유발하며 만성 간질환의 주 원인이다. 알코올성 간염이 진행되면 간섬유화를 동반하고 간경변으로 심화되며 간세포암으로 발전한다. 간세포암은 재발율이 높고 빈번한 전이로 인하여 예후가 좋지 않다. 알코올성 간질환 및 간세포암은 조기 진단의 어려움이 있고, 효과적인 치료를 위한 진단 마커가 부족하며 치료 약제 및 치료 전략이 불충분하다. 본 연구에서는 알코올로 인한 간세포 손상을 제어하고 간세포암의 진행을 억제하는 신규 마이크로RNA를 발굴하고, 해당 유전자의 병태생리적 기능 및 조절 기전을 탐구하고자 하였다. 이를 위하여 1) 간염 환자와 알코올 섭취 동물 모델을 사용하여 알코올에 의한 마이크로RNA 변화 분석과 이에 따른 간세포 손상 기전 탐구, 2) 간세포암 환자 및 이종이식 동물을 이용하여 간세포암에서 마이크로RNA 변화 및 타겟 분자 도출을 통한 간세포암 악성화 기전 탐구를 구체적 연구 목표로 설정하였다.
알코올성 간염 환자 및 알코올 투여 동물모델에서 miR-148a의 발현이 감소함을 관찰하였다. 또한 알코올성 간염 환자의 마이크로어레이 네트워크 분석을 통해 알코올에 의한 교란 신호 조절의 핵심 유전자로 FoxO1을 도출하였고, 알코올 처리시 FoxO1이 감소함을 확인하였다. FoxO1과 miR-148a의 발현은 상관성이 높았고, 세포 실험을 통해 FoxO1이 miR-148a의 전사인자임을 확인하였다. MiR-148a는 직접적으로 TXNIP의 발현을 억제하였다. 알코올에 의한 TXNIP의 발현 증가는 NLRP3 inflammasome의 활성화를 촉진하고 간세포의 pyroptosis를 유도하였으며, 이는 miR-148a 과발현 또는 TXNIP의 발현 억제에 의해 감소하였다. 렌티바이러스를 이용하여 miR-148a를 간세포 선택적으로 과발현시 알코올에 인한 간세포의 손상이 억제되었다.
미세혈관 침습이 있는 간세포암 환자의 시료에서 miR-148a의 발현은 감소하였고, miR-148a의 발현 감소에 따라 간세포암 환자의 전체 생존률과 무재발 생존률이 감소하였다. USP4의 발현은 간세포암 환자에서 증가하였고, 세포 실험에서 miR-148a이 직접적으로 USP4의 발현을 억제함을 증명하였다. MiR-148a의 감소에 따른 USP4의 발현 증가는 중간엽성 간암세포주에서 현저하였고, 이는 암세포의 이동과 증식을 촉진하였다. MiR-148a와 USP4의 역상관성을 간세포암 환자 및 이종이식동물 모델에서 확인하였다. 또한 환자 유래 간암 이종이식 동물 모델에서도 miR-148a의 발현이 감소하는 G1과 G2 암세포에서 USP4의 발현이 증가했으며, 이는 종양 이식의 단계가 진행되어도 miR-148a와 USP4의 역상관성이 유지됨을 의미한다.
종합할 때, 본 연구결과는 간세포 손상을 제어하고 간세포암의 진행을 억제하는 miR-148a의 새로운 기능 및 조절기전을 제시한다. 알코올성 간세포 손상을 제어하는 신규 조절자로서 miR-148a의 발견과 그 상위 조절 전사인자로서 FoxO1의 발굴, 하위 염증성 세포사멸을 일으키는 단백질로 TXNIP를 도출하였다. 또한 간세포암의 악성화에 관여하는 miR-148a 신호 회로를 밝혔으며, 타겟 유전자의 발현 억제를 통한 암세포의 증식 및 이동성 억제 효능을 검증하였다. 이러한 성과는 간질환을 이해하고 이를 활용하여 질병을 치료하는 원리를 도출하는데 활용될 수 있을 것으로 기대한다.

목차 (Table of Contents)

• I. 서론 1
• II. 연구재료 및 방법 6
• 시약 및 재료 6
• 인체 조직 시료 6
• 병리 동물모델 7
• 세포 배양 7
• 마이크로RNA의 Realtime RT-PCR 8
• cDNA의 Real-time RT-PCR 9
• 조직학적 검사 10
• 생물정보학적 분석 10
• 면역화학적 분석 (Immunoblot analysis) 11
• 세포 분획법 11
• 형질도입 (Transfection) 11
• 리포터 유전자 분석 (Reporter gene assay) 12
• 3'UTR 리포터 유전자 분석 13
• 염색질면역침전법 (Chromatin immunoprecipitation assays) 13
• 유세포측정법 13
• 면역침강법 14
• 렌티바이러스 (lentivirus)를 이용한 세포 선택적 유전자 전달. 14
• 체외 세포의 이동성 분석법 15
• MTT 정량 분석법 15
• 통계분석 16
• III. 연구결과 17
• 1. 알코올에 의한 간세포 손상 모델에서 miR-148a의 발현 변화 17
• 2. 알코올에 의한 간세포 손상 모델에서 FoxO1의 발현 변화 20
• 3. FoxO1에 의한 전사적 miR-148a의 발현 조절. 23
• 4. 알코올에 의한 간세포 손상 모델에서 miR-148a에 의한 TXNIP 발현조절 26
• 5. TXNIP 의존적 inflammasome에 의한 간세포의 pyroptosis 31
• 6. 알코올에 의해 손상된 간세포에서의 inflammasome 활성 35
• 7. 간세포 선택적 miR-148a 발현에 의한 간세포 손상 억제 38
• 8. MiR-148a 변화에 따른 간세포암의 진행 41
• 9. 중간엽성 간암세포주에서 USP4의 발현 변화 46
• 10. MiR-148a에 의한 USP4의 발현 변화 48
• 11. USP4 의존적 TGF신호 조절. 50
• 12. 종양 이식 동물 실험. 53
• IV. 고찰 56
• V. 참고문헌 67
• VI. Abstract 79