Protein Kinase 억제제 첨가 후 Platelet-Activating Factor에 의하여 자극된 호중구반응의 변경

이강건(Kang-Kun Lee),고지영(Ji-Young Ko),함동석(Dong-Suk Ham),신용규(Yong-Kyoo Shin),이정수(Chung-Soo Lee) 대한약리학회 1996 대한약리학잡지 Vol.32 No.1

Roles of protein kinase C and protein tyrosine kinase in the activation of neutrophil respiratory burst, degranulation and elevation of cytosolic Ca²⁺ in platelet-activating factor (PAF)-stimulated neutrophils were investigated. Superoxide and H₂O₂ production and myeloperoxidase and acid phosphatase release in PAF-stimulated neutrophils were inhibited by protein kinase C inhibitors, staurosporine and H-7 and protein tyrosine kinase inhibitors, genistein and tyrphostin. The PAF-induced elevation of [Ca²⁺]<sub>i</sub in neutrophils was inhibited by staurosporine, genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate. Staurosporine inhibited both intracellular Ca²⁺ release and Mn²⁺ influx in PAF-stimulated neutrophils. Genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate inhibited Mn²⁺ influx induced by PAF, whereas their effects on intracellular Ca²⁺ release were not detected. In neutrophils preactivated by PMA, the stimulatory effect of PAF on the elevation of [Ca²⁺]_i was reduced. Protein kinase C and protein tyrosine kinase may be involved in respiratory burst, lysosomal enzyme release and Ca²⁺ mobilization in PAF-stimulated neutrophils. The elevation of [Ca²⁺]<sub>i</sub appears to be accomplished by intracullular Ca²⁺ release and Ca²⁺ influx which are differently regulated by protein kinases. Preactivation of protein kinase C appears to attenuate the stimulatory action of PAF on intracellular Ca²⁺ mobilization. Platelet-activating factor (PAF)에 의하여 자극된 호중구 respiratory burst, 탈과립과 세포질 칼슘농도의 증가에 있어 protein kinase C와 protein tyrosine kinase의 역할을 관찰하였다. PAF에 의하여 자극된 호중구에서 superoxide 및 H₂O₂의 생성과 myeloperoxidase와 acid phosphatase의 유리는 protein kinase C 억제제인 staurosporine과 H-7 그리고 protein tyrosine kinase 억제제인 genistein과 tyrphostin에 의하여 억제되었다. PAF에 의한 호중구 세포내 칼슘농도의 증가는 staurosporine, genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate에 의하여 억제 되었다. Staurosporine은 PAF에 의하여 자극된 호중구에서 세포내 칼슘유리와 망간유입을 억제 하였다. Genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate는 PAF에 의한 망간유입을 억제하였으나, 세포내 칼슘유리에 대한 이들의 효과는 관찰되지 않았다. PMA에 의하여 활성화된 호중구에서 세포내 칼슘농도의 증가에 대한 PAF의 자극효과는 감소되었다. Protein kinase C와 protein tyrosine kinase는 PAF에 의하여 자극된 호중구에서의 respiratory burst, lysosomal enzyme유리와 칼슘동원에 관여할 것으로 제시된다. 세포내 칼슘농도의 증가는 protein kinase의 영향을 다르게 받는 세포내 칼슘유리와 세포외부로 부터의 칼슘유입에 의하여 이루어질 것으로 추정된다. Protein kinase C가 활성화되어 있는 상태에서 세포내 칼슘동원에 대한 PAF의 자극작용은 감소될 것으로 시사된다.

Alteration of the Activated Responses in Platelet-Activating Factor-Stimulated Neutrophils by Protein Kinase Inhibitors

이강건,고지영,함동석,신용규,이정수,Lee, Kang-Kun,Ko, Ji-Young,Ham, Dong-Suk,Shin, Yong-Kyoo,Lee, Chung-Soo The Korean Society of Pharmacology 1996 대한약리학잡지 Vol.32 No.1

Platelet-activating factor (PAF)에 의하여 자극된 호중구 respiratory burst, 탈과립과 세포질 칼슘농도의 증가에 있어 protein kinase C와 protein tyrosine kinase의 역할을 관찰하였다. PAF에 의하여 자극된 호중구에서 superoxide 및 $H_2O_2$의 생성과 myeloperoxidase와 acid phosphatase의 유리는 protein kinase C 억제제인 staurosporine과 H-7 그리고 protein tyrosine kinase 억제제인 genistein과 tyrphostin에 의하여 억제되었다. PAF에 의한 호중구 세포내 칼슘농도의 증가는 staurosporine, genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate에 의하여 억제 되었다. Staurosporine은 PAF에 의하여 자극된 호중구에서 세포내 칼슘유리와 망간유입을 억제 하였다. Genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate는 PAF에 의한 망간유입을 억제하였으나, 세포내 칼슘유리에 대한 이들의 효과는 관찰되지 않았다. PMA에 의하여 활성화된 호중구에서 세포내 칼슘농도의 증가에 대한 PAF의 자극효과는 감소되었다. Protein kinase C와 protein tyrosine kinase는 PAF에 의하여 자극된 호중구에서의 respiratory burst, lysosomal enzyme유리와 칼슘동원에 관여할 것으로 제시된다. 세포내 칼슘농도의 증가는 protein kinase의 영향을 다르게 받는 세포내 칼슘유리와 세포외부로 부터의 칼슘유입에 의하여 이루어질 것으로 추정된다. Protein kinase C가 활성화되어 있는 상태에서 세포내 칼슘동원에 대한 PAF의 자극작용은 감소될 것으로 시사된다. Roles of protein kinase C and protein tyrosine kinase in the activation of neutrophil respiratory burst, degranulation and elevation of cytosolic $Ca^{2+}$ in platelet-activating factor (PAF)-stimulated neutrophils were investigated. Superoxide and $H_2O_2$ production and myeloperoxidase and acid phosphatase release in PAF-stimulated neutrophils were inhibited by protein kinase C inhibitors, staurosporine and H-7 and protein tyrosine kinase inhibitors, genistein and tyrphostin. The PAF-induced elevation of $[Ca^{2+}]_i$ in neutrophils was inhibited by staurosporine, genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate. Staurosporine inhibited both intracellular $Ca^{2+}$ release and $Mn^{2+}$ influx in PAF-stimulated neutrophils. Genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate inhibited $Mn^{2+}$ influx induced by PAF, whereas their effects on intracellular $Ca^{2+}$ release were not detected. In neutrophils preactivated by PMA, the stimulatory effect of PAF on the elevation of $[Ca^{2+}]_i$ was reduced. Protein kinase C and protein tyrosine kinase may be involved in respiratory burst, lysosomal enzyme release and $Ca^{2+}$ mobilization in PAF-stimulated neutrophils. The elevation of $[Ca^{2+}]_i$ appears to be accomplished by intracullular $Ca^{2+}$ release and $Ca^{2+}$ influx which are differently regulated by protein kinases. Preactivation of protein kinase C appears to attenuate the stimulatory action of PAF on intracellular $Ca^{2+}$ mobilization.

고양이 위 평활근에서 KCI에 의한 근수축에 대한 Protein Kinase의 조절

심상수,김승록,심혜선,이덕주,한상준,윤신희,조양혁,김명석 大韓消化器病學會 1998 大韓消化器病學會誌 Vol.32 No.3

핵 내에서 분리한 Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase의 Transcription Factor에 대한 인산화

김윤석(Yoon-Suk Kim),김소영(So-Young Kim),김태우(Tae-Ue Kim) 대한의생명과학회 1996 Biomedical Science Letters Vol.2 No.2

모든 진핵세포에 존재하며 세포의 성장 및 분화에 주로 관계되는 신호전달물질의 하나인 Mitogen-activated protein(MAP) kinase의 mitogen에 의한 핵내 활성화와 기질 인산화에 대해 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. P388 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지에 배양한 후, 혈청이 들어있지 않은 배지에서 24시간 더 배양하고 serum 및 PMA를 농도별로 처리하여 세포성장을 위한 최적농도를 확인한 결과 serum은 5-20% 농도에서 세포성장을 촉진시켰고 PMA는 실험한 모든 농도에서 세포성장을 거의 촉진시키지 못하는 경향을 확인하였다. 이어 P388 세포를 serum 및 PMA로 10 분간 활성화하여 파쇄한 후 세포질분획과 핵분획으로 분리하여 각 분획을 10% gel상에서 전기영동 하여 nitrocellulose paper에 옮긴 후 anti-ERK1 antibody를 이용해 확인해본 결과 serum, PMA로 처리된 세포 모두에서 MAP kinase의 핵내 이동이 관찰되었으며 특히 세포질 내에 주로 존재하는 42, 44 Kd의 MAP kinase isoform중 42 Kd의 isoform이 주로 핵내로 이동되는 것이 관찰 되었다. MAP kinase의 기질인산화실험을 위해 serum으로 활성화시킨 세포를 파쇄하여 SP-sephadex C-50, Phenyl superose, Mono Q column의 순서로 chromatography를 시행하여 MAP kinase를 부분분리 하였다. 이와 같이 얻은 MAP kinase를 가지고 면역 T 세포에 존재하는 tyrosine kinase인 p56<SUP>lck</SUP>대의 N-terminal peptide로 구성된 GST-fusion protein에 대한 인산화를 확인하였다. 또한 세포에서 분리한 MAP kinase를 가지고 transcription factor의 하나인 c-Jun protein에 대한 인산화실험을 실시한 결과 MAP kinase에 의해 인산화 됨이 확인되었다. 이상의 결과를 통해 P388 세포는 (1)세포 성장시 외부 신호를 G-protein-coupled receptor/protein kinase C/MAP kinase의 경로보다는 주로 tyrosine kinase receptor protein/Ras/MAP kinase의 경로를 이용하여 핵으로 전달하는 것으로 추측되며 (2) mitogen의 처리로 활성화된 MAP kinase중 주로 42 Kd isoform 핵내로 이동하고, 분리한 MAP kinase가 GST-fusion protein과 transcription factor인 c-Jun을 모두 인산화 시키는 결과로 보아 MAP kinase의 isoform에 따라 표적 compartment가 다르고 결과적으로 표적 기질에 차이가 있을지 모른다고 간접적으로 추론 할 수 있다. The mitogen-activated protein(MAP) kinase signal transduction pathway represents an important mechanism by which mitogen, such as serum and PMA, regulate cell proliferation and differentiation. Target substrates of the MAP kinase are located within several compartments containing plasma membranes and nucleus. We now report that serum addition induces proliferation of the P388 murine leukemia cell, but PMA does not, while both serum and PMA treatment cause translocation of the MAP kinase, mainly p42<SUP>mapk</SUP> isoform, from cytosol into the nucleus, which was monitored by immunoblot analysis using polyclonal anti-ERK1 antibodies. We investigated whether the MAP kinase was capable of phosphorylating c-Jun protein and GST-fusion proteins, the P56<SUP>lck</SUP>N-terminal peptides (1-77 or 1-123 domain) of the T cell tyrosine kinase, using the partially purified MAP kinase by SP-sephadex C-50, phenyl superose and Mono Q column chromatography. We found that the partially purified MAP kinase was able to phosphorylate c-Jun protein and the GST-fusion protein expressed using E.coli DH5α which is transformed with pGEX-3Xb plasmid vector carrying of p56<SUP>lck</SUP> N-terminal peptide-encoding DNA. These results imply that tyrosine kinase receptor/Ras/Raf/MAP kinase pathway is a major mechanism for mitogen-induced cell proliferation in P388 murine leukemia cell and that the various MAP kinase isoforms may have their own target substrates located in distinct subcellular compartments.

핵 내에서 분리한 Mitogen-Activated Protein (MAP) Kinase의 Transcription Factor에 대한 인산화

김태우,김소영,김윤석 THE KOREAN SOCIETY FOR BIOMEDICAL LABORATORY SCIEN 1996 Journal of biomedical laboratory sciences Vol.2 No.2

모든 진핵세포에 존재하며 세포의 성장 및 분화에 주로 관계되는 신호전달물질의 하나인 Mitogen-activated protein(MAP) kinase의 mitogen에 의한 핵내 활성화와 기질 인산화에 대해 알아보기 위해 본 실험을 수행하였다. P388 세포를 10% fetal bovine serum이 첨가된 DMEM 배지에 배양한 후, 혈청이 들어있지 않은 배지에서 24시간 더 배양하고 serum 및 PMA를 농도별로 처리하여 세포성장을 위한 최적농도를 확인한 결과 serum은 5-20% 농도에서 세포성장을 촉진시켰고 PMA는 실험한 모든 농도에서 세포성장을 거의 촉진시키지 못하는 경향을 확인하였다. 이어 P388 세포를 serum 및 PMA로 10 분간 활성화하여 파쇄한 후 세포질분획과 핵분획으로 분리하여 각 분획을 10% gel상에서 전기영동 하여 nitrocellulose paper에 옮긴 후 anti-ERK1 antibody를 이용해 확인해본 결과 serum, PMA로 처리된 세포 모두에서 MAP kinase의 핵내 이동이 관찰되었으며 특히 세포질 내에 주로 존재하는 42, 44 Kd의 MAP kinase isoform중 42 Kd의 isoform이 주로 핵내로 이동되는 것이 관찰되었다. MAP kinase의 기질인산화실험을 위해 serum으로 활성화시킨 세포를 파쇄하여 SP-sephadex C-50, Phenyl superose, Mono Q column의 순서로 chromatography를 시행하여 MAP kinase를 부분분리 하였다. 이와 같이 얻은 MAP kinase를 가지고 면역 T 세포에 존재하는 tyrosine kinase인 p56lck의 N-terminal peptide로 구성된 GST-fusion protein에 대한 인산화를 확인하였다. 또한 세포에서 분리한 MAP kinase를 가지고 transcription factor의 하나인 c-Jun protein에 대한 인산화실험을 실시한 결과 MAP kinase에 의해 인산화 됨이 확인되었다. 이상의 결과를 통해 P388 세포는 (1)세포 성장시 외부 신호를 G-protein-coupled receptor/protein kinase C/MAP kinase의 경로보다는 주로 tyrosine kinase receptor protein/Ras/MAP kinase의 경로를 이용하여 핵으로 전달하는 것으로 추측되며 (2) mitogen의 처리로 활성화된 MAP kinase중 주로 42 Kd isoform이 핵내로 이동하고, 분리한 MAP kinase가 GST-fusion protein과 transcription factor인 c-Jun을 모두 인산화 시키는 결과로 보아 MAP kinase의 isoform에 따라 표적 compartment가 다르고 결과적으로 표적 기질에 차이가 있을지 모른다고 간접적으로 추론할 수 있다. The mitogen-activated protein(MAP) kinase signal transduction pathway represents an important mechanism by which mitogen, such as serum and PMA, regulate cell proliferation and differentiation. Target substrates of the MAP kinase are located within several compartments containing plasma membranes and nucleus. We now report that serum addition induces proliferation of the P388 murine leukemia cell, but PMA does not, while both serum and PMA treatment cause translocation of the MAP kinase, mainly p42mapk isoform, from cytosol into the nucleus, which was monitored by immunoblot analysis using polyclonal anti-ERK1 antibodies. We investigated whether the MAP kinase was capable of phosphorylating c-Jun protein and GST-fusion proteins, the P56lckN-terminal peptides (1-77 or 1-123 domain) of the T cell tyrosine kinase, using the partially purified MAP kinase by SP-sephadex C-50, phenyl superose and Mono Q column chromatography. We found that the partially purified MAP kinase was able to phosphorylate c-Jun protein and the GST-fusion protein expressed using E.coli DH5α which is transformed with pGEX-3Xb plasmid vector carrying of p56lck N-terminal peptide-encoding DNA. These results imply that tyrosine kinase receptor/Ras/Raf/MAP kinase pathway is a major mechanism for mitogen-induced cell proliferation in P388 murine leukemia cell and that the various MAP kinase isoforms may have their own target substrates located in distinct subcellular compartments.

Regulatory Action of Protein Tyrosine Kinase in Intracellular Calcium Mobilization in C5a-stimulated Neutrophils

최원태,한은숙,이정수,Choi, Won-Tae,Han, Eun-Sook,Lee, Chung-Soo The Korean Society of Pharmacology 1996 대한약리학잡지 Vol.32 No.3

본 연구는 C5a에 의해 자극된 호중구에서 세포내 칼슘유리와 세포외부로부터 칼슘유입에 있어 protein kinase C와 protein tyrosine kinase의 관여 여부를 조사하였다. Protein kinase C 억제제인 staurosporine과 H-7은 C5a에 의해 자극된 호중구에서 세포내 칼슘유리를 억제하였으나, 세포막을 교차한 칼슘유입이나 세포내 칼슘농도 증가에 영향을 나타내지 않았다. C5a에 의한 세포내 칼슘유리와 칼슘유입은 protein tyrosine kinase 억제제인 genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate에 의해서 억제 되었다. ADP에 의해 야기된 세포내 칼슘농도의 증가는 genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate에 의해서 억제되었으나 staurosporine과 H-7의 영향은 받지 않았다. Genistein과 methyl-2,5-dihydroxy-cinnamate는 thapsigargin을 처리한 호중구에서 칼슘유입을 감소시켰으나 이에 대한 staurosporine 과 H-7의 효과는 나타나지 않았다. 호중구를 phorbol 12-myristate 13-acetate로 전처치하였을때 세포내 칼슘증가에 미치는 C5a의 자극 효과는 감소하였다. 이상의 결과로 부터 protein tyrosine kinase는 C5a에 의해 활성화된 호중구에서 세포내 칼슘유리와 세포막을 교차한 칼슘유입의 조절에 관여할 것으로 추정된다. The present study was done to examine the involvement of protein kinase C and protein tyrosine kinase in intracellular $Ca^{2+}$ mobilization in C5a-stimulated neutrophils. Although protein kinase C inhibitors, staurosporine and H-7 inhibited intracellular $Ca^{2+}$ release in C5a-stimulated neutrophils, they did not affect $Ca^{2+}$ influx across the plasma membrane and elevation of $[Ca^{2+}]_i$ C5a-induced intracellular $Ca^{2+}$ release and $Ca^{2+}$ influx were inhibited by protein tyrosine kinase inhibitors, genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate. ADP-evoked elevation of $[Ca^{2+}]_i$ was inhibited by genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate but was not affectd by staurosporine and H-7. Genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate reduced the store-regulated $Ca^{2+}$ influx in thapsigargin-treated neutrophils, while the effect of staurosporine and H-7 was not detected. When neutrophils were preincubated wih phorbol 12-myristate 13-acetate, the stimulatory effect of C5a on the elevation of $[Ca^{2+}]_i$ was reduced. These results suggest that protein tyrosine kinase may be involved in control of intracellular $Ca^{2+}$ release and $Ca^{2+}$ influx across the plasma membrane in C5a-activated neutrophils.

C5a에 의해 자극된 호중구에서 세포내 칼슘동원에 대한 Protein Tyrosine Kinase의 조절작용

최원태(Won-Tae Choi),한은숙(Eun-Sook Han),이정수(Chung-Soo Lee) 대한약리학회 1996 대한약리학잡지 Vol.32 No.3

본 연구는 C5a에 의해 자극된 호중구에서 세포내 칼슘유리와 세포외부로부터 칼슘유입에 있어 protein kinase C와 protein tyrosine kinase의 관여 여부를 조사하였다. Protein kinase C 억제제인 staurosporine과 H-7은 C5a에 의해 자극된 호중구에서 세포내 칼슘유리를 억제하였으나, 세포막을 교차한 칼슘유입이나 세포내 칼슘농도 증가에 영향을 나타내지 않았다. C5a에 의한 세포내 칼슘유리와 칼슘유입은 protein tyrosine kinase 억제제인 genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate에 의해서 억제 되었다. ADP에 의해 야기된 세포내 칼슘농도의 증가는 genistein과 methyl-2,5-dihydroxycinnamate에 의해서 억제되었으나 staurosporine과 H-7의 영향은 받지 않았다. Genistein과 methyl-2,5-dihydroxy-cinnamate는 thapsigargin을 처리한 호중구에서 칼슘유입을 감소시켰으나 이에 대한 staurosporine 과 H-7의 효과는 나타나지 않았다. 호중구를 phorbol 12-myristate 13-acetate로 전처치하였을때 세포내 칼슘증가에 미치는 C5a의 자극 효과는 감소하였다. 이상의 결과로 부터 protein tyrosine kinase는 C5a에 의해 활성화된 호중구에서 세포내 칼슘유리와 세포막을 교차한 칼슘유입의 조절에 관여할 것으로 추정된다. The present study was done to examine the involvement of protein kinase C and protein tyrosine kinase in intracellular Ca²⁺ mobilization in C5a-stimulated neutrophils. Although protein kinase C inhibitors, staurosporine and H-7 inhibited intracellular Ca²⁺ release in C5a-stimulated neutrophils, they did not affect Ca²⁺ influx across the plasma membrane and elevation of [Ca²⁺]_i C5a-induced intracellular Ca²⁺ release and Ca²⁺ influx were inhibited by protein tyrosine kinase inhibitors, genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate. ADP-evoked elevation of [Ca²⁺]_i was inhibited by genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate but was not affectd by staurosporine and H-7. Genistein and methyl-2,5-dihydroxycinnamate reduced the store-regulated Ca²⁺ influx in thapsigargin-treated neutrophils, while the effect of staurosporine and H-7 was not detected. When neutrophils were preincubated wih phorbol 12-myristate 13-acetate, the stimulatory effect of C5a on the elevation of [Ca²⁺]_i was reduced. These results suggest that protein tyrosine kinase may be involved in control of intracellular Ca²⁺ release and Ca²⁺ influx across the plasma membrane in C5a-activated neutrophils.

Gene cloning and utility phophorylation assay of a protein-fused substrate for a highly sensitive detection of cdc2 protein kinase using a radioisotope detection technique for the development of a protein biochip

Ko, Kyong-Cheol,Choi, Mi Hee,Park, Sang Hyun John Wiley Sons, Ltd. 2009 Journal of labelled compounds & radiopharmaceutica Vol.52 No.4

<P>The prototype of the cdc2 protein kinase in mammalian cells regulates its entry into mitosis by phosphorylating a group of key proteins in the major cell cycle transitions. In this study, using the mep45 gene encoding the 45 kDa major envelope protein (Mep45) of Selenomonas ruminantium, a rumen bacteria, a Mep45-fused substrate (PKTPKKAKKL-Mep45, MFS-cdc2) was cloned to detect the activity of cdc2 protein kinase. We report here on a strategy for the detection of a phosphorylation of a substrate catalyzed by cdc2 protein kinase by using a radioisotope detection technique. It is possible to constantly obtain a reasonable quantity of MFS-cdc2 for the cdc2 protein kinase assay and its cost can be as low as a synthesized peptide. Results of the study indicate that the Mep45-fused protein can be used effectively as a substrate for detecting the activity of cdc2 protein kinase and it can be used in developing a protein biochip for a high-throughput screening and also for studying protein–protein interactions. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd.</P> <B>Graphic Abstract</B> <P>Gene cloning and utility phophorylation assay of a protein-fused substrate for a highly sensitive detection of cdc2 protein kinase using a radioisotope detection technique for the development of a protein biochip Kyong-Cheol Ko, Mi Hee Choi, Sang Hyun Park<SUP>*</SUP>Using the mep45 gene encoding the 45 kDa major envelope protein (Mep45) of Selenomonas ruminantium, a rumen bacteria, a Mep45-fused substrate (PKTPKKAKKL-Mep45, MFS-cdc2) was cloned to detect the activity of cdc2 protein kinase. We report here on a strategy for the detection of a phosphorylation of a substrate catalyzed by cdc2 protein kinase by using a radioisotope detection technique. Copyright © 2009 John Wiley & Sons, Ltd. <img src='wiley_img/03624803-2009-52-4-JLCR1579-gra001.gif' alt='wiley_img/03624803-2009-52-4-JLCR1579-gra001'> </P>

Characterization of a CK II Protein Kinase from Etiolated Oat Seedlings

김상엽,Yong-Woo Kim,Dong-Kyoon Kim,Su-Nam Kwak,In-Soo Kim 한국분자세포생물학회 2002 Molecules and cells Vol.14 No.1

Protein kinases play a central role in controlling the cellular metabolism of living organisms. A protein kinase was purified from etiolated oat seedlings by several steps of ion-exchange and affinity chroma-tographies. The kinase was a 150-kDa tetrameric pro-tein and composed of three subunits of 34, 37, and 40 kDa proteins. The 34 and 40 kDa proteins had ATP binding sites, suggesting that they are catalytic sub-units and that the 37-kDa protein is a regulatory sub-unit. In the in vitro phosphorylation of a crude oat cell extract, it intensively phosphorylated a serine residue of a 110-kDa protein. The 110-kDa protein was tenta-tively identified as a DNA topoisomerase I, based on an amino acid sequence homology. Phosphorylation of the 110-kDa protein by the kinase required ATP or GTP as a phosphoryl group donor. The kinase activity was inhibited by 50% at a concentration of 0.05 mg/ml heparin. These results, therefore, indicate that the puri-fied kinase is a CK II protein kinase and may be invol-ved in the regulation of DNA topoisomerase I activity.

분열유발인자에 의한 흰쥐 림프구 단백의 인산화

주일로(Ilo Jou),고성수(Sung Soo Ko),안영수(Young Soo Ahn) 대한약리학회 1993 대한약리학잡지 Vol.29 No.1

흰쥐 말초 T림프구에 분열유발 물질인 PMA와 Con A를 투여하여 인산화되는 단백을 확인하고, PKC 억제제인 H-7, CaM kinase 억제제인 W-7을 전처치한 후의 인산화 변동과 시간 경과에 따른 인산화 변동을 관찰하였다. 그 결과 흰쥐 T림프구를 PMA로 자극하면 5개의 인산화 단백이 새로이 나타나고 7개 단백의 인산화가 증가 되었으며, Con A자극으로는 1개의 단백이 새로이 인산화 되고 7개 단백의 인산화가 증가되었다. PMA 및 Con A자극으로 인산화 되는 13개 단백은 kinase억제제 전처치에 의하여 3군으로 각각 구분되며, H-7 전처치로 24 kDa/pI 7.1, 24/7.2, 26/6.1, 74/6.2 단백의, W-7 전처치로 14 kDa/pI5.9, 28/6.8, 29/6.9, 28/7.0, 44/6.8, 58/6.2 단백의 인산화가 현저히 감소 되었으며, 18 kDa/p1 5.4, 25/7.3 및 54/5.2단백은 두 억제제에 의해 영향을 받지 않았다. 이들 인산화 단백은 대부분 세포의 soluble fraction에서 확인되며 자극후 반응 초기에 인산화 된 후 인산화가 감소하나, 침전물에서 관찰되는 소수의 인산화 단백은 지속적인 인산화를 보였다. 한편 Kinase 억제제 처리에 의하여 구분된 3군에 속하는 단백들의 시간에 따른 인산화 양상을 관찰한 결과 각 군에 따른 인산화 양상에 상호 연관성이 없었다. 이상의 실험결과로 보아 림프구 활성의 초기 단계에서 인산화 되는 단백에는 PKC, CaM kinase 및 다른 kinase에 의해 인산화 되는 3종류의 단백이 존재하며, 3종류의 kinase의 활성은 단계적인 활성이 아니라 독립적 또는 상호 협동적으로 작용하여 림프구 활성을 유발시키는 것으로 생각된다. This study was done to classify the proteins involved in the specific phosphorylation using the rat peripheral blood lymphocytes (rPBL) stimulated with mitogens, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and concanavalin A (Con A). The lymphocytes were incubated with ³²P-orthophosphate before PMA or Con A stimulation. The migration patterns of the phosphorylated proteins of mitogen-treated rPBL in two dimensional electrophoretic fields were analyzed after autoradiography. The stimulation of the lymphocytes with PMA and Con A increased the phosphorylation of thirteen protein fractions. The phosphorylation intensities of the protein spots differ to the treatments of the cells with specific kinase inhibitors, H-7 and W-7. These protein fractions were grouped into 3 classes, namely, PKC-mediated, CaM kinase-mediated, and other kinase mediated proteins. The effect of the duration of the stimulation on the phosphorylated behaviors occurred concurrently, not sequentially, although each individual protein fraction had a different time for the peak phosphorylation during the stimulation period upto 30 minutes. The phosphoproteins found in the cytosolic soluble fraction were phosphorylated prior to those in the pellet, whose phosphorylations were sustained at a high level for over 10 minutes. The above results suggest that the early events in lymphocyte activation involve 3 different sets of proteins which are phosphorylated by CaM kinase, PKC and other kinases, and those kinases do not work sequentially, but rather, independently or cooperatively.