Tetracycline Inducible Retrovirus Vector System에 의한 GFP 유전자의 발현 조절

구본철,권모선,김태완 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2005 Reproductive & developmental biology Vol.29 No.1

본 연구에서는 retrovirus를 이용한 유전자 전이에 있어서 대두되는 큰 문제점의 하나인 외래 유전자의 지속적인 발현으로 인한 개체의 생리적인 손상을 최소화하기 위하여 tetracycline계 물질의 공급 여부에 따라서 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 one vector 형태의 Tet-On system을 구축하고자 하였다. 또한 WPRE 서열을 이 vector 상에 도입하여 유도적 조건에서 외래 유전자의 발현이 보다 강하게 일어날 수 있는 효율적인 retrovirus vector system을 확립하고자 하였다. 구축한 각각의 vector system에서 fluorometry와 western blotting을 이용하여 GFP 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과, RevTRE-EGFP-WPRE-RSVp-rtTA2SM2 virus를 이용하여 유전자를 전이시킨 표적세포에서 GFP의 절대적인 발현량이 가장 큰 것으로 나타났고, 유전자 발현의 turn on/off에 의한 유도율은 RevTRE-EGFP-RSVp-rtTA2SM2-WPRE virus의 경우에서 8∼21배로 가장 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 외래 유전자의 발현을 효율적으로 조절할 수 있는 vector system은 WPRE가 rtTA2SM2 서열의 3에 위치한 형태로, 이 system을 이용하여 생산한 고감염가의 virus는 유전자 치료나 형질전환 동물의 생산에 있어서 요구되는 외래 유전자의 발현을 효율적으로 조절할 수 있는 수단이 될 것이다. One of the critical problems to be solved in transgenic animal production is uncontrollable constitutive expression of foreign genes, which usually results in serious physiological disturbances in the transgenic animal. To circumvent this problem, we constructed and tested two retrovirus vectors designed to express the GFP(green fluorescent protein) gene under the control of the tetracycline-inducible promoters. To maximize the GFP gene expression at turn-on state, WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) sequence was introduced into the retrovirus vectors at downstream region of either the GFP gene or the sequence encoding rtTA(reverse tetracycline-controlled transactivator). Transformed cells were cultured in the medium supplemented with or without doxycycline(tetracycline derivative) for 48 hours, and induction efficiency was measured by comparing the GFP gene expression level using fluorometry and western blotting. Higher GFP expression was observed from the vector carrying the WPRE sequence at 3'' side of the GFP gene, while tighter expression control(up to 20 fold) was obtained from the vector in which the WPRE sequence was placed at 3'' side of rtTA sequence. The resulting tetracycline inducible vector system may be used in transgenic animal production and gene therapy.

Tetracycline Inducible Retrovirus Vector System에 의한 GFP 유전자의 발현 조절

구본철,권모선,김태완 충남대학교 형질전환복제돼지연구센터 2007 논문집 Vol. No.10

본 연구에서는 retrovirus를 이용한 유전자 전이에 있어서 대두되는 큰 문제점의 하나인 외래 유전자의 지속적인 발현으로 인한 개체의 생리적인 손상을 최소화하기 위하여 tetracycline계 물질의 공급 여부에 따라서 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 one vector 형태의 Tet-On system을 구축하고자 하였다. 또한 WPRE 서열을 이 vector 상에 도입하여 유도적 조건에서 외래 유전자의 발현이 보다 강하게 일어날 수 있는 효율적인 retrovirus vector system을 확립하고자 하였다. 구축한 각각의 vector system에서 fluorometry와 western blotting을 이용하여 GFP 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과,RevTRE-EGFP-WPRE-RSVp-rtTA2SM2 virus를 이용하여 유전자를 전이시킨 표적세포에서 GFP의 절대적인 발현량이 가장 큰 것으로 나타났고,유전자 발현의 turn on/off에 의한 유도율은 RevTRE-EGFP-RSVp-rtTA2SM2-WPRE virus의 경우에서 8∼21배로 가장 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 외래 유전자의 발현을 효율적으로 조절할 수 있는 vector system은 WPRE가 rtTA2SM2 서열의 3´에 위치한 형태로,이 system을 이용하여 생산한 고감염가의 virus는 유전자 치료나 형질전환 동물의 생산에 있어서 요구되는 외래 유전자의 발현을 효율적으로 조절할 수 있는 수단이 될 것이다. One of the critical problems to be solved in transgenie animal production is uncontrollable constitutive expression of foreign genes, which usually results in serious physiological disturbances in the transgenic animal. To circumvent this problem, we constructed and tested two retrovims vectors designed to express the GFP(green fluorescent protein) gene under the control of the tetracycline-indudble promoters. To maximize the GFP gene expression at turn-on state, WPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriphonal regulatory element) sequence was introduced into the retrovirus vectors at downstream region of either the GFP gene or the sequence encoding rtTA(reverse tetracycline-controlled transactivator). Transformed cells were cultured in the medium supplemented with or without doxycydine(tetracydine derivative) for 48 hours, and induction efficiency was measured by comparing the GFP gene expression level using fluorometry and western blotting. Higher GFP expression was observed from the vector carrying the WPRE sequence at 3' side of the GFP gene, while tighter expression control(up to 20 fold) was obtained from the vector in which the WPRE sequence was placed at 3' side of rtTA sequence. The resulting tetracycline inducible vector system may be used in transgenic animal production and gene therapy.

여러 표적세포에서 Retrovirus Vector의 내부 Promoter의 종류와 WPRE의 유무에 따른 GFP 유전자의 발현 효율성 비교

김영혜,구본철,권모선,김태완 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2004 Reproductive & developmental biology Vol.28 No.3

본 실험에서는 외래 유전자의 효율적인 발현을 위하여 GFP 표지유전자를 이용하여 여러 종류의 promoter를 검정하였다. 또한, retrovirus vector에 WPRE 서열을 도입함으로써 GFP 유전자의 발현 증가 여부를 확인하였다. 모든 표적 세포에 있어서 UbC와 β-actin promoter에 비해 RSV와 CMV promoter 통제하의 GFP의 발현이 더 강하게 나타났으며, 특히 CEF 세포에서는 RSV promoter가 가장 우수한 것으로 확인되었다. WPRE의 도입으로 인한 발현율의 증가는 CEF를 제외한 세포주에서 promoter의 종류에 관계없이 확인되었다. 이상의 결과로 각 세포주는 promoter에 따라 발현 양상이 약간의 차이를 보이고 있으나 RSV와 CMV promoter에서 유전자의 발현이 보다 효율적이며, WPRE 서열이 도입된 경우에 HeLa와 PFF 세포에서 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 연구 결과는 효율적인 유전자의 발현 체계를 확립하는데 기여함으로써 더 나아가 유전자 치료나 형질전환 동물생산에 적극적으로 활용되어질 수 있을 것이다. In this study, to construct more effective retrovirus system, we compared four internal promoters (RSV: Rous sarcoma virus, UbC: Ubiquitin C, β-actin, CMV: human cytomegalovirus) in the retrovirus vector by measuring GFP (green fluorescent protein) expression. The effect of WPRE (woodchuck hepatitis virus posttrans-criptional regulatory element) sequence on transgene expression was also investigated. Experiments were conducted with cells derived from three different species (human, pig and chicken) and evaluated the activity of each promoter and the effect of WPRE sequence by fluorometry and Western blotting. In all cells tested, RSV and CMV promoters were superior to UbC and β-actin promoters, and RSV promoter was the best one in chicken cells. The boosting effect of WPRE sequence on GFP expression was evident in human and porcine cells but not in chicken cells.

Tetracycline Inducible Retrovirus Vector System을 이용한In Vitro에서의 인간 부갑상선 호르몬의 발현 조절

구본철,권모선,김태완 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2006 Reproductive & developmental biology Vol.30 No.3

본 연구에서는 인간 부갑상선 호르몬의 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 retrovirus vector system을 확립하고자 하였다. 이에 tetracycline계 물질로 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 one vector 형태의 Tet-On system을 이용하였으며 WPRE 서열을 도입하여 유도적 조건에서 외래 유전자의 발현을 증가시켰다. 구축한 각각의 표적세포에서 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 hPTH 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과, WPRE가 hPTH의 3' 위치에 도입된 RevTRE-PTH- WPRE-CMVp-rtTA2SM2 virus를 이용하여 유전자를 전이시킨 경우에 hPTH의 발현량이 가장 높은 것으로 나타났고, 또한 유도율도 가장 큰 것으로 확인되었다. 이 system을 이용하여 생산한 고감염가의 virus는 인간의 부갑상선 호르몬을 생산하기 위한 동물세포주의 구축이나 형질전환 동물의 생산에 있어서 매우 효율적인 유전자 전이 수단이 될 것으로 사료된다. Endogenous 84 amino acid parathyroid hormone (PTH) is synthesized as a pre-pro hormone by the chief cells of the parathyroid glands. Physiological actions of PTH include regulation of bone metabolism, renal tubular reabsorption of calcium and phosphate, and intestinal calcium absorption. In addition, PTH stimulates new bone formation by extraordinary stimulation of osteoblastic activity and decreasing calcium excretion by the kidney. In this study, we constructed and tested retrovirus vectors designed to express the human parathyroid hormone (hPTH) gene under the control of the tetracycline-inducible promoters. To increase the hPTH gene expression at turn-on state, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) sequence was also introduced into retrovirus vector at downstream region of either the hPTH gene or the sequence encoding reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA). Transformed primary culture cells (porcine fetal fibroblast, PFF, chicken embryonic fibroblast, CEF) were cultured in the medium supplemented with or without doxycycline (tetracycline derivative) for 48 hours, and induction efficiency was measured by comparing the hPTH gene expression level using two step RT-PCR and ELISA. Higher hPTH expression (3×104 pg/ml, 5.3×104 pg/ml) and tighter expression control (up to 8 fold) were observed from the vector in which the WPRE sequence was placed at downstream of the hPTH gene. The resulting tetracycline inducible vector system may be helpful in solving serious physiological disturbance problems which have been a major obstacle in successful production of transgenic animals.

Tetracycline Inducible Retrovirus Vector System을 이용한 In Vitro에서의 인간 부갑상선 호르몬의 발현 조절

구본철,권모선,김태완 충남대학교 형질전환복제돼지연구센터 2007 논문집 Vol. No.10

본 연구에서는 인간 부갑상선 호르몬의 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 retrovirus vector system을 확립하고자 하였다. 이에 tetracycline계 물질로 발현을 유도적으로 조절할 수 있는 one vector 형태의 Tet-0n system율 이용하였으며 WPRE 서열을 도입하여 유도적 조건에서 외래 유전자의 발현을 증가시켰다. 구축한 각각의 표적세포에서 RT-PCR과 ELISA를 이용하여 hPTH 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과, WPRE가 hPTH의 3' 위치에 도입된 RevTRE-PTH-WPRE-CMVp-rtTA2^(s)M2 virus를 이용하여 유전자를 전이시킨 경우에 hPTH의 발현량이 가장 높은 것으로 나타났고,또한 유도율도 가장 큰 것으로 확인되었다. 이 system을 이용하여 생산한 고감염가의 virus는 인간의 부갑상선 호르몬을 생산하기 위한 동물세포주의 구축이나 형질전환 동물의 생산에 있어서 매우 효율적인 유전자 전이 수단이 될 것으로 사료된다. Endogenous 84 amino add parathyroid hormone (PTH) is synthesized as a pre-pro hormone by the chief cells of the parathyroid glands, Physiological actions of PTH indude regulation of bone metabolism, renal tubular reabsorption of calcium and phosphate, and intestinal calcium absorption. In addition, PTH stimulates new bone formation by extraordinaiy stimulation of osteoblastic activity and decreasing calcium excretion by the kidney, In this study, we constructed and tested retrovirus vectors designed to express the human parathyroid hormone (hPTH) gene under the control of die tetracycine-inducible promoters. To increase the hPTH gene expression at turn-on state, woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE) sequence was also introduced into letrovirus vector at downstream region of either the hPTH gene or the sequence encoding reverse tetracycline-controlled transactivator(rtTA). Transformed primary culture cells (porcine fetal fibroblast, PFF, chicken embryonic fibroblast, CEF) were cultured in the medium supplemented with or without doxycycline (tetracyline derivative) for 48 hours, and induction efficiency was measured by comparing the hPTH gene expiession level using two step RT-PCR and ELISA. Higher hPTH expression (3×10^(4) pg/ml, 5.3×10^(4) pg/ml) and tighter expression control (up to 8 fold) were observed from the vector in which the WPRE sequence was placed at downstream of the hPTH gane. The resulting tetracycline inducible vector system may be helpful in solving serious physiological disturbance problems which have been a major obstacle in successful production of transgenic animals.

재조합 hTPO 유전자의 발현 조절을 위한 Retrovirus Vector System의 구축

권모선,구본철,김도향,김태완 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2007 Reproductive & developmental biology Vol.31 No.3

본 연구에서는 외래 유전자의 지속적인 발현에 의한 형질 전환 개체나 세포의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 hTPO 유전자의 발현을 조절할 수 있는 tetracycline-inducible retrovirus vector system을 구축하고자 하였다. hTPO 유전자는 사람의 간암세포인 HepG2에서 분리한 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR 방법을 이용하여 확보하였으며, 이 유전자를 MLV 유래의 vector에 도입하여 pLNChTPOW를 재조합하였다. 재조합한 vector는 GP2 293 포장세포에 도입하여 바이러스를 생산하였으며, 이 바이러스를 이용하여 감염시킨 여러 표적세포에서 hTPO의 발현을 확인하였다. 또한, hTPO의 발현을 유도적으로 조절할 수 있도록 하기 위하여 hTPO를 one vector 형태의 Tet-On vector system에 도입하였으며, 발현의 유도 조건에서 보다 강한 발현을 위하여 WPRE 서열을 여러 위치에 도입하였다. 구축한 Tet system의 발현 조절 정도는 각 바이러스를 감염시켜서 구축한 CEF와 PFF 세포에서 RT-PCR과 Western blot, 그리고 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과, CEF에서는 WPRE 서열이 hTPO 유전자의 3'에 위치한 경우에서, PFF에서는 WPRE가 rtTA의 3'에 위치한 경우의 vector system에서 가장 높은 발현율과 유도율을 나타내었다. 이는 Tet system에서의 hTPO 유전자 발현 조절이 매우 효율적으로 이루어지며, 세포주에 따른 의존적인 조절 양상을 보이는 것을 의미한다. 따라서 hTPO의 대량 생산을 위한 생체 반응기로서의 형질 전환 동물의 개발을 보다 효율적으로 수행하려면 적절한 Tet system이 선별적으로 적용되어야 할 것이다. In this study, we constructed and tested retrovirus vectors designed to express the human thrombopoietin gene under the control of the tetracycline-inducible promoters. To increase the hTPO gene expression at turn-on state, WPRE sequence was also introduced into retrovirus vector at downstream region of either the hTPO gene or the sequence encoding reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA). Primary culture cells (PFF, porcine fetal fibroblast; CEF, chicken embryonic fibroblast) infected with the recombinant retrovirus were cultured in the medium supplemented with or without doxycycline for 48 hr, and induction efficiency was measured by comparing the hTPO gene expression level using RT-PCR, western blot and ELISA. Higher hTPO expression and tighter expression control were observed from the vector in which the WPRE sequence was placed at downstream of the hTPO (in CEF) or rtTA (in PFF) gene. This resulting tetracycline inducible vector system may be helpful in solving serious physiological disturbance problems which have been a major obstacle in successful production of transgenic animals.

FIV-Tet-On Vector System을 이용한 hG-CSF 유전자의 효율적인 발현 조절

권모선,구본철,김태완 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2007 Reproductive & developmental biology Vol.31 No.3

본 연구에서는 hG-CSF의 발현을 유도적으로 조절하기 위한 FIV-Tet-On lentivirus vector system을 구축하고자 하였다. hG-CSF는 호중성구 계열 세포의 증식과 분화, 생존에 영향을 미치는 물질로서, 이 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 FIV-Tet-On vector 상의 hG-CSF나 rtTA2SM2 서열의 3' 위치에 WPRE 서열을 도입하였다. 구축된 각각의 vector는 293FT 세포에 일시적으로 transfection하여 virus를 생산하였으며, 이 virus를 일차 배양 세포인 CEF와 PFF에 감염시켰다. 각 세포에 전이된 hG-CSF의 발현 양상을 관찰하기 위하여 doxycycline을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지에서 배양한 후 quantitative real-time PCR, Western blot과 ELISA를 이용하여 hG-CSF 유전자의 발현 정도를 비교 측정한 결과, CEF에서는 WPRE가 hG-CSF의 3' 위치에 도입된 경우에 발현량과 유도율이 가장 높은 것으로 나타났고, PFF에서는 rtTA 서열의 3'위치에 도입된 경우에 발현량과 유도율이 가장 큰 것으로 확인되었다. 이 FIV-Tet-On vector system은 형질 전환 동물의 생산이나 유전자 치료에서 문제시되는 외래 유전자의 지속적인 과다 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용을 최소화하기 위한 해결 방법으로 제시될 수 있을 것이다. In this study, using FIV-based lentivirus vector system, we tried to express hG-CSF in tetracycline-controllable manner. hG-CSF influences the proliferation, differentiation, and survival of cells in the neutrophil lineage. To enhance stability and translation of hG-CSF transcript, WPRE sequence was also introduced into FIV-Tet-On vector at downstream region of either the hG-CSF gene or the sequence encoding rtTA. Primary culture cells (CEF, chicken embryonic fibroblast; PFF, porcine fetal fibroblast) infected with the recombinant FIV were cultured in the medium supplemented with or without doxycycline for 48 hours, and induction efficiency was measured by comparing the hG-CSF gene expression level using quantitative real-time PCR, Western blot and ELISA. Higher hG-CSF expression and tighter expression control were observed from the vector in which the WPRE sequence was placed at downstream of the hG-CSF (in CEF) or rtTA (in PFF) gene. This FIV-Tet-On vector system may be helpful in solving serious physiological disturbance problems which has continuously hampered successful production of transgenic animals and gene therapy.

Retrovirus Vector System을 이용한 hPTH가 발현되는 돼지 세포의 구축

정지연,구본철,김남형,권모선,박성환,김태완 한국동물생명공학회(구 한국동물번식학회) 2004 Reproductive & developmental biology Vol.28 No.3

골다공증 치료제로 이용되고 있는 hPTH는 체내의 혈중 칼슘 농도를 조절하는 인간의 부갑상선 호르몬이다. 본 연구에서는 hPTH를 효율적으로 생산하는 돼지세포를 구축하고자 다양한 retrovirus vector를 이용하였는데 다음과 같은 결과를 관찰하였다. 1) hPTH 유전자의 전이를 확인하기 위해 RT-PCR을 수행한 결과, 형질전환된 모든 돼지세포에서 420 bp의 hPTH에 해당하는 단편을 확인할 수 있었으며, WPRE가 도입되지 않은 실험군보다 WPRE서열이 도입된 실험군에서 더 강한 밴드를 확인하였다. 2) ECLIA 측정 결과 hPTH 유전자가 도입된 모든 세포에서 hPTH가 생성되었으며, 특히 Tet-On system에서는 doxycycline을 처리한 실험군에서 hPTH의 발현이 유도되었음을 확인하였다. 또한 RT-PCR과 ECLIA을 수행하여 hPTH의 도입 여부와 단백질 생산을 비교한 결과, WPRE 서열이 hPTH 유전자의 downstream 위치에 도입된 실험군에서 가장 많은 단백질이 생산됨을 확인할 수 있었다. Human PTH (parathyroid hormone) is known to be efficacious for curing osteoporesis. In this study, we attempted to construct genetically modified porcine cell lines that can ultimately be used for donor cells in nuclear transfer-mediated transgenesis. By using retrovirus vectors carrying tetracycline-regulatory expression system and WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) sequence, we could control PTH expression with tetracycline and boost the promoter activity. Considering that low or constitutive expression of the transgene has been one of major problems that needs to be solved in transgenic animal studies, our results could be helpful in successful production of transgenic pigs as bioreactors.

일차배양한 동물세포주에서의 효율적인 유전자 발현 조절 시스템의 확립

권모선,김민지,노지열,김태완,구본철 한국동물번식학회 2012 Reproductive & developmental biology Vol.36 No.2

현재 널리 사용되고 있는 목적 유전자 발현 조절 시스템은 Gossen과 Bujard에 의해 개발 된 tetracycline-inducible gene expression system (Tet system)으로서, 유도체인 tetracycline 계열의 물질의 공급 여부에 따라 외래 유전자의 발현을 가역적이며 유도적으로 조절할 수 있다. 이 시스템은 중금속이나 steroid hormone 등을 이용한 발현 조절 시스템에 비해 발 현 유도율이 높고 비특이적인 발현이 상대적으로 낮으며, 유도물질에 의한 세포 독성이나 다 면 적 영향이 거의 나타나지 않는 장점을 가진다. 그러나 비유도 조건에서 완벽한 발현 억제가 이루어 지지 않은 관계로 background 활성이 미미하게 존재하고 있어서 이를 해결하기 위 한 연구가 진행되고 있으며 유도물질에 대한 transactivator의 감수성을 향상시켜서 낮은 유 도체의 농도에서도 유전자의 발현을 극대화하기 위한 시도도 이루어지고 있다. 본 연구에서는 가장 개선된 형태의 Tet system의 각 요소들을 재조합하여 one vector 형 태의 유전자 발현 조절 시스템을 구축한 후, 일차배양한 세포주에서 이 시스템의 효율성을 증명하고자 하였다. 재조합한 요소는 유전자 발현 조절을 위한 Tet system의 구성에 있어 서 가장 중요한 2가지 요소인 transactivator와 tetracycline response element (TRE)로 각 각 의 일부 서열이 변형된 형태이다. 도입한 transactivator는 유도 조건에서의 외래 유전자의 발현을 극대화시키고 발현 유도물질인 doxycycline에 대한 감수성을 높여서 저농도의 doxycycline 조건에서도 발현 유도가 가능하다. 또한, 변형된 TRE 서열에는 endogenous mammalian transcription factor 결합 부위가 존재하지 않으므로 transactivator가 없는 경우 유전 자의 발현이 turn on되지 않으므로 background 활성이 거의 나타나지 않는다. 실제적으로 기존의 Tet system에서는 비유도 조건에서의 외래 유전자인 GFP의 발현을 미미하게 나타 낸 데에 비해 개선된 Tet system에서는 GFP의 발현이 거의 나타나지 않았다. 또한, 유도 조건에서는 기존의 system에 비해 새롭게 구축한 system에서 강한 발현을 나타내었으며 발현 유도율도 매우 높은 것으로 확인되었다. 구축한 Tet vector system에서 WPRE 서열의 위치와 표적세포주의 종류에 따른 GFP의 발현 양상을 확인한 결과, 소의 태아섬유아세포 에서는 WPRE가 transactivator 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 발현이 가장 강하게 나 타났으며 닭의 배아섬유아세포에서는 WPRE가 TRE 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 강한 발현을 보였다. 본 연구에서 구축한 개선된 형태의 Tet system은 완벽한 외래 유전자의 발현 조절을 가 능하게 함으로써 세포 수준에서나 개체 수준에서의 관련 연구에 있어서 유용한 유전자 전 이 수단으로 이용될 수 있을 것이다.

일차배양한 동물세포주에서의 효율적인 유전자 발현 조절 시스템의 확립

권모선,김민지,노지열,김태완,구본철 한국동물번식학회 2012 Reproductive & Developmental Biology(Supplement) Vol.36 No.2s

현재 널리 사용되고 있는 목적 유전자 발현 조절 시스템은 Gossen과 Bujard에 의해 개발 된 tetracycline-inducible gene expression system (Tet system)으로서, 유도체인 tetracycline 계열의 물질의 공급 여부에 따라 외래 유전자의 발현을 가역적이며 유도적으로 조절할 수 있다. 이 시스템은 중금속이나 steroid hormone 등을 이용한 발현 조절 시스템에 비해 발 현 유도율이 높고 비특이적인 발현이 상대적으로 낮으며, 유도물질에 의한 세포 독성이나 다 면 적 영향이 거의 나타나지 않는 장점을 가진다. 그러나 비유도 조건에서 완벽한 발현 억제가 이루어 지지 않은 관계로 background 활성이 미미하게 존재하고 있어서 이를 해결하기 위 한 연구가 진행되고 있으며 유도물질에 대한 transactivator의 감수성을 향상시켜서 낮은 유 도체의 농도에서도 유전자의 발현을 극대화하기 위한 시도도 이루어지고 있다. 본 연구에서는 가장 개선된 형태의 Tet system의 각 요소들을 재조합하여 one vector 형 태의 유전자 발현 조절 시스템을 구축한 후, 일차배양한 세포주에서 이 시스템의 효율성을 증명하고자 하였다. 재조합한 요소는 유전자 발현 조절을 위한 Tet system의 구성에 있어 서 가장 중요한 2가지 요소인 transactivator와 tetracycline response element (TRE)로 각 각 의 일부 서열이 변형된 형태이다. 도입한 transactivator는 유도 조건에서의 외래 유전자의 발현을 극대화시키고 발현 유도물질인 doxycycline에 대한 감수성을 높여서 저농도의 doxycycline 조건에서도 발현 유도가 가능하다. 또한, 변형된 TRE 서열에는 endogenous mammalian transcription factor 결합 부위가 존재하지 않으므로 transactivator가 없는 경우 유전 자의 발현이 turn on되지 않으므로 background 활성이 거의 나타나지 않는다. 실제적으로 기존의 Tet system에서는 비유도 조건에서의 외래 유전자인 GFP의 발현을 미미하게 나타 낸 데에 비해 개선된 Tet system에서는 GFP의 발현이 거의 나타나지 않았다. 또한, 유도 조건에서는 기존의 system에 비해 새롭게 구축한 system에서 강한 발현을 나타내었으며 발현 유도율도 매우 높은 것으로 확인되었다. 구축한 Tet vector system에서 WPRE 서열의 위치와 표적세포주의 종류에 따른 GFP의 발현 양상을 확인한 결과, 소의 태아섬유아세포 에서는 WPRE가 transactivator 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 발현이 가장 강하게 나 타났으며 닭의 배아섬유아세포에서는 WPRE가 TRE 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 강한 발현을 보였다. 본 연구에서 구축한 개선된 형태의 Tet system은 완벽한 외래 유전자의 발현 조절을 가 능하게 함으로써 세포 수준에서나 개체 수준에서의 관련 연구에 있어서 유용한 유전자 전 이 수단으로 이용될 수 있을 것이다. * 본 연구는 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(과제번호: PJ007990042012)의 지원에 의해 이루어졌다.