Purification and Characterization of Peroxidase from Streptomyces sp. ND002

한윤전,정병철 명지대학교 자연과학연구소 2002 자연과학논문집 Vol.21 No.-

본 실험은 아조계 염료인 congo-red에 대한 분해능이 밝혀져 있는 Streptomyces sp. ND002균주에서 peroxidase를 분리·정제하여 그 역할을 규명하는데 목적을 두고 수행되었다. Streptomyces sp. ND002 균주를 pH 7.0의 조건에서 DJMM배지를 사용하여 배양을 실시한 결과 최고 5Units/ml의 세포 외 peroxidase 활성을 나타내었다. 균주 배양액을 이용하여 Q sepharose FF anion exchange column, Superdex 200 pg gel filtration column, Phenyl sepharose HP hydrophobic interaction column, Mono Q HIR anion exchange column chromatography를 통하여 최종적으로 speecific activity가 68.63 U/mg protein인 peroxidase를 부분 정제하였다. 정제과정 중 perosidase 활성이 분리되어 나타나는 것으로 보아 streptomyces sp. ND002 균주는 최소 3종류 이상의 2,4-DCP 분해능을 지니는 peroxidase를 세포 외로 분비하는 것으로 보이며, 부분 정제된 peroxidase에 대한 특성 파악 결과 pH7.5와 30℃의 온도에서 활성이 높게 나타남을 확인할 수 있었고, 중성이상의 pH와 4℃에서 보존성이 높다는 결과를 얻었다. 또한 분리과정 중 peroxidase 활성을 나타내는 fraction에서 색을 뛴다는 사실을 통해 wave scan한 결과 400nm의 파장에서 높은 흡광도를 나타내며, heme protein inhilbitor인 NaN_3, KCN를 넣어주고 활성을 측정한 결과 NaN3의 경우 98%, KCN의 경우 54%의 활성의 감소가 확인되었다. 이상의 결과로 미루어 보아 현재 부분 정제된 peroxidase 는 기존의 Streptomyces viridosporus T7A에서 분리된 ALiP-P3와 같은 특징을 지니는 heme-peroxidase로 사료된다. Streptomyces sp. ND002 is a gram-positive soil actinomycetes secreting an uncharacterized 2,4-dichlorophenol (DCP) oxidizing enzyme, whose activity is similar to the previously know Actinomycetes Lignin Peroxidase (ALiP). This extracellular peroxidase was purified from Streptomyces sp. ND002 by Q-sepharose, Superdex 200pg, Phenyl sepharose HP, Mono Q HIR column chromatography. The highest level of peroxidase activity was observed at pH7.5 and 30℃. The purified peroxidase was inhibited by 1 mM sodium azide and potassium cyanide treatment. Additionally, purified peroxidase exhibited and absorption spectrum at 400 nm. Thus, these results and observations suggest that this perxidase is heme protein, like ALiP-P3.

광합성 세균 Rhodospirillum rubrum S1이 생성한 Catalase-Peroxidase의 부분 정제 및 특성 규명

김영미,이동헌,강형일,오덕철 濟州大學校 基礎科學硏究所 2001 基礎科學硏究 Vol.14 No.2

호기적으로 배양한 광합성 세균 Rhodospirillum rubrum SI은 5 가지의 catalase를 생성함을 알 수 있었다. 그 중 peroxidase의 기능도 동시에 갖는 catalase-peroxidase(Cat-3)를 부분 정제하고 그 특성을 조사하였다. 부분정제된 catalase-peroxidase의 수율은 catalase가 1.6% 그리고 peroxidasse가 5.1% 였으며, 정제 배수가 4.6배와 14배로 증가한 효소를 얻을 수 있었는데, catalase보다 peroxidase의 정제배수가 더 높았다. pH에 대한 영향은 catalase활성은 pH6에서, peroxidase활성은 pH5에서 가장 높게 나타났다. 온도에 대한 영향은 catalase와 peroxidase 활성이 모두 30℃에서 최고의 활성을 보이는 것으로 나타났으며, 온도에 대한 효소의 안정성은 50℃에서 catalase가 peroxidase보다 더 안정함을 알 수 있었다. 부분정제된 catalase-peroxidase에 유기용매와 10mM 3-amino-1,2,4-triazole을 처리한 결과, 유기용매에 대해 catalase의 활성은 79%, peroxidase의 활성은 85%까지 억제됨을 알 수 있었으며, 10mM 3-amino-1,2,4-triazole에 대한 각 효소의 활성은 그대로 유지되고 있었다. 전형적인 heme단백질 효소들의 저해제로 알려진 NaCN, NaN3, NH20H를 농도별로 처리한 결과, NaCN인 경우 catalase는 8.72×10-s M의 농도에서, peroxidase는 5.1×10-s M의 농도에서, NaN3에서 catalase는 4.2×10-7 M, peroxidase는 3.2×10-7 M, NH20H에서는 catalase인 경우는 2.0×10-7 M, peroxidase인 경우는 2.5×10-7M 농도에서 억제되었으며, 이들 저해제들은 catalase활성과 peroxidase활성을 동시에 저해하는것으로 나타났다. Five different catalases have been already found in the aerobically grown photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum S1. Among them, a bifunctional catalase-peroxidase, designated Cat-3 was partially purified and characterized. The enzyme was purified through four steps in 1.6% yield for catalatic activity and 5.1% yield for peroxidatic activity. On the basis of catalatic activity, the protein purification increased nearly 4.6-fold, whereas for peroxidatic activity, an approximately 14-fold purification was achieved. The optimum pHs of the catalatic and peroxidatic activities were 6 and 5, respectively, and the optimum temperature for both activities was 30℃. The catalatic activity of the enzyme maintained at 50℃ for lh was more stably than peroxidatic activity. The catalatic and peroxidatic activities were inhibited about 79 % and 85 % by exposure to organic solvent(ethanol/chloroform), respectively. Both enzymatic activities were not neally inhibited by lOmM 3-amino-1,2,4-triazole. Fifty percent enzyme inhibition of the catalatic activity was reached with 2.0×10^(-7)M, hydroxylamine, 4.2×10^(-7)M azide and 8.7×10^(-6)M cyanide, and that of the peroxidatic activity was obtained with 2.5×10^(-7)M hydroxylamine, 3.2×10^(-7)M azide and 5.1×10^(-6)M cyanide.

Effect of Calcium on Immobilization of Rice (Oryza sativa L.) Peroxidase for Bioassays in Sodium Alginate and Agarose Gel

Kavita Shah,Sareeta Nahakpam,Puneeta Singh 한국생물공학회 2008 Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol.13 No.5

The direct immobilization of soluble peroxidase isolated and partially purified from shoots of rice seedlings in calcium algi-nate beads and in calcium agarose gel was carried out. Peroxidase was assayed for guaiacol oxidation products in pres-ence of hydrogen peroxide. The maximum specific activity and immobilization yield of the calcium agarose immobilized per-oxidase reached 2,200 U mg-¹ protein (540 mU cm-³ gel) and 82%, respectively. In calcium alginate the maximum activity of peroxidase upon immobilization was 210 mU g-¹bead with 46% yield. The optimal pH for agarose immobilized peroxidase was 7.0 which differed from the pH 6.0 for soluble peroxidase. The optimum temperature for the agarose immobilized per-oxidase however was 30°C, which was similar to that of soluble peroxidase. The thermal stability of calcium agarose immo-bilized peroxidase significantly enhanced over a temperature range of 30~60°C upon immobilization. The operational stabil-ity of peroxidase was examined with repeated hydrogen peroxide oxidation at varying time intervals. Based on 50% conver-sion of hydrogen peroxide and four times reuse of immobilized gel, the specific degradation of guaiacol for the agarose im-mobilized peroxidase increased three folds compared to that of soluble peroxidase. Nearly 165% increase in the enzyme protein binding to agarose in presence of calcium was noted. The results suggest that the presence of calcium, ions help in the immobilization process of peroxidase from rice shoots and mediates the direct binding of the enzyme to the agarose gel and that agarose seems to be a better immobilization matrix for peroxidase compared to sodium alginate.

해바라기(Helianthus annus L.) 배양세포의 Cellular Peroxidase 활성을 억제하는 비병원성 Elicitor의 확인

송지연,신광숙,이인철 대전대학교 기초과학연구소 1999 自然科學 Vol.10 No.2

효모(Sacharomyces cerevisiae)의 세포벽 성분은 가장 잘 알려진 nonpathogenic elicitor이다. 이런 종류의 elicitor가 식물세포의 생리적 변화를 유도하는 기작을 규명하기 위하여 해바라기(Helianthus annus L.)의 배양 세포에 투여한 후 peroxidase 활성 변화를 측정하였다. 선행된 실험에서 보여주는 바 장미나 담배의 배양세포에서 yeast-elicitor는 peroxidase 의 활성, 특히 extracellular peroxidase 의 활성을 증가시켰으며, 기존의 peroxidase 와 구분되는 isoperoxidase 의 de novo synthesis를 유도한다는 증거를 얻은 바 있다. 그러나 해바라기 배양세포에서는 동일한 eliciting에 대하여 extracellular peroxidase의 활성변화는 관찰되지 않았으며 cellular peroxidase가 오히려 감소되는 결과를 얻었다. 효모 세포벽 성분을 DEAE-cellulose, CM-sepharose 및 concanavalin A-sepharose chromatography를 통하여 분획한 결과 DEAE-celluose로부터 용출된 분획과 concanavalin A로부터 용출된 분획이 peroxidase 의 활성을 억제하였으며 이러한 억제는 시료를 투석하여 glucan의 농도가 감소하는 것에 비례적으로 감소하였다. 그러므로 상기와 같은 반응을 유도하는 성분은 oligosaccharides라고 판단되었다. 이러한 결과는 동일한 elicitor에 대하여 식물의 종에 따라 반응하는 양식이 다름을 보여주는 결과라고 생각된다. Cell wall components of yeast (Sacharomyces cerevisiae) is well known nonpathogenic elicitor in some plant. To identify the chemical properties of yeast elicitor, the elicitor was isolated by ethanol precipitation followed by DEAE-cellulose, CM-sepharose and concanavalin A-sepharose chromatography. In contrast to the effect of elicitor in cultured cells of rose or tobacco, same elicitor from yeast has been found to suppress the peroxidase activity in cultured sunflower(Helianthus annus L.) cells. The inhibitory elicitor on peroxidase activity was detected in fractions eluted from DEAE-cellulose and from concanavalin A-sepharose column. The inhibitory effect of DEAE-fraction, however, was decreased by dialysis against distilled water using dialysis tubing with molecular cut off 1,000 Da. which suggested the yeast elicitor might be a oligosacharide. These results showed that plant might respond in different physiological ways to the same elicitor according to the plant species.

Soybean peroxidase의 추출공정 및 안정성 특성

서경림,이은규 한국생물공학회 1998 KSBB Journal Vol.13 No.5

Soybean peroxidase was extracted from soybean hulls and purified by ammonium sulfate precipitations (25% and 75% saturation), pl fractionation, and anionic exchange and gel filtration chromatographies (DEAE-Sephadex A-50 and Superose 12). Modlecular weight and pl value were estimated to be ca. 45 kD and 4.2, respectively. Purified soybean peroxidase had an RZ value of 0.43. Compared with horseradish peroxidase, it showed superior thermal and pH stability. Assuming the first-order kinetics, the thermal deactivation rate constant of soybean peroxidase at 80$^{\circ}C$ was about 8 times lower than that of horseradish peroxidase. Deactivation energy was calculated to be 69.3 kcal/mol. Soybean peroxidase showed about 10% higher H2O2 degradation capacity than horseradish peroxidase. Exploiting these advantages, the soybean peroxidase purified from the domestic soybean hull is expected to replace horseradish peroxidase in various applications.

인삼 Peroxidase(PgPrx3) 유전자의 분리 및 연초의 형질전환

손화,심주선,김세영,노영덕,김무성,양덕춘 경희대학교식량자원개발연구소 2005 硏究論文集 Vol.24 No.-

Peroxidase는 항산화에 관련된 효소이며 식물의 환경스트레스와 성장에 관련되는 중요한 유전자이다. 본 실험에서 사용된 Peroxidase Ⅲ의 cDNA는 Panax ginseng C.A. Meyer 잎에서 추출하였으며 PgPrx3라 명명하였다. 이 gene의 ORF영역은 1,065 bP이고 355개의 아미노산을 가지고 있다. BioEdit 프로그램을 이용하여 PgPrx3와 다른 식물의 peroxidase gene과 비교한 결과 상동성을 가지고 있었으며, Spinacia oleracea(70%), Vigna angulais(71%), Nicotiana tabacum(69%) and Linum usitatissimum(65%). 그중 Vigna angularis의 상동성이 가장 높았다. 담배에 본 유전자를 형질전환시켜 유전자의 특성을 검정하기 위하여 35S/35S/AMV/peroxidas/Tnos를 벡터 pRD400에 재조합 후 아그로박테리아를 이용하여 담배에 도입시켰다. 그리고 PCR를 이용하여 유전자 PgPrx3가 담배에 도입된 것을 확인하였으며, RT-PCR로 정상적으로 PgPrx3 유전자가 전사되어 RNA를 생성하고 있음을 확인하였다. A peroxidase (E.C. 1.11.1.7) is very important enzyme as antioxidants. The function of this gene is connected with growth and environmental stress of plant. A class Ⅲ peroxidase cDNA was isolated from the leaf of Panax ginseng C.A. Meyer and named as PgPrx3 which is consisted of an ORF (open reading frame) of 1,065 bp and an amino acid of 355 residues. BioEdit software was used to compare the PgPrx3 amino acid sequence with other plants that showed homologies with Spinacia oleracea (70%), Vigna angularis (71%), Nicotiana tabacum (69%) and Linum usitatissimum (65%). The peroxidase of Vigna angulatis was the most homologous with ginseng. The chimeric PgPrx3 gene, 35S/35S/AMV/peroxidas/ Tnos, was constructed in the binary vector pRD400. Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring disarmed Ti-plasmid was used to transform Nicotiana tabacum L. using the leaf disc. Incorporation of the chimeric gene PgPrx3 into plants were confirmed by PCR analysis of genomic DNA and RT-PCR analysis of mRNA from transgenic tobacco. The PgPrx3 gene from ginseng was stably expressed in transgenic tobacco plants.

콩나물 Peroxidase를 이용한 포도당의 효소적 분석

이민경 한국생명과학회 1998 생명과학회지 Vol.8 No.4

Soybean sprouts peroxidase can be used for enzymatic determination of glucose. Peroxidase from soybean sprouts was purified by ammonium sulfate precipitation and DEAE Sephacel column chromatography. The glucose could be quantitatively assayed by using glucose oxidase and soybean sprouts peroxidase. The optimum pH and temperature for glucose assay were of pH 5.5 and $40^{\circ}C$, respectively. The relationship between absorbance and glucose concentration was linear. And also the relationship between absorbance and reaction time was linear. The reducing agents such as L-cysteine, dithiothreitol inhibited the glucose assay by glucose oxidase and soybean sprouts peroxidase. 콩나물 줄기로부터 추출, 정제한 peroxidase는 glucose oxidase와 함께 guaiacol을 기질로 사용하여 포도당의 분석에 사용되었다. peroxidase는 DEAE-Sephacel ion exchange column chromatography를 통해 얻은 분획이 조효소액에 비해 specific activity가 10.8배 증가되었고 수율은 11.3%였다. 정제된 peroxidase와 glucose oxidase를 이용한 포도당 분석의 최적 pH는 5.5였고 최적온도는 $40^{\circ}C$로 나타났으며 포도당 양의 증가에 따라 효소활성은 증가되었으며 반응시간과의 관계에서도 직선을 보여 주었다. 그리고 L-cysteine과 dithiothreitol과 같은 환원제는 포도당 분석에 이용되는 glucose oxidase와 콩나물 peroxidase의 활성을 저해하는 것으로 나타났다.

배추 기원 Peroxidase의 정제 및 성질

이해익,박경숙,최용순,이상영 한국산업미생물학회 1991 한국미생물·생명공학회지 Vol.19 No.5

Peroxidase를 다량 함유하는 식물체를 검색할 목적으로 십자화과 식물 9종에 대하여 효소활성 분포를 조사하였다. 검색한 식물체 중 배추 뿌리에서 본 효소의 활성이 강하게 나타나 배추 뿌리로부터 본 효소의 정제를 행하였다. 정제된 효소는 분자량 50,000의 단량체로서 pH 7.0, 50℃에서 최적 활성을 나타내었다. phenol 및 phenol 유도체가 좋은 기질로 작용하였으며 pyrogallol에 대한 H_2O_2의 Km값은 1.6mM이었다. 본 효소는 406㎚에서 Soret 흡수대를 나타내어 다른 peroxidase와 마찬가지로 분자내 보결분자단으로 heme을 가지고 있음을 알았다. 정제된 배추뿌리 기원의 효소는 면역화학적, 전기영동적 성질이 horseradish 기원의 peroxidase와 유사하였다. The distribution of peroxidase activity in 9 kinds of cruciferous plants was investigated. Among the plants examined, peroxidase activity was found to be high levels in roots of Chinese cabbage. One kind of peroxidase was purified approximately 56-fold from crude extracts of Chinese cabbage roots. The molecular weight of the enzyme was 50,000 and consisted oif a single polypeptide chain, as estimated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis and Sephadex G-150 gel column chromatography. The enzyme showed optimum activity at pH 7.0 and 50℃. Phenol and phenol derivatives serves as substrates of the enzyme and Km value for H_2O_2 was 1.6 mM toward pyrogallol. The enzyme showed a Soret band at 406 ㎚ and this result indicate that the enzyme contained heme as a prosthetic group. The immurochemical and electrophoretic properties of purified peroxidase from Chinese cabbage were very similar to horseradish peroxidase.

장미(Rosa sp. cv. Paul's Scarlet) 액체배양세포의 배지로부터 분리한 Extracellular Peroxidase의 특징

이인철 대전대학교 기초과학연구소 1997 自然科學 Vol.8 No.1

장미 (rosa sp. cv. Paul's Scarlet) 액체 배양 세포로부터 배지로 분비되는 extracellular peroxidase 의 성질을 조사하였다. 등전점 전기영동과 specific staining을 통하여 pl 8.4와 8.2의 등전점을 갖는 isoperoxidase가 확인되는 바, 본 실험에서는 pl 8.4인 peroxidase를 분리하였다 Acetone처리에 의하여 농축된 효소는 CM-sepharose와 Sephadex G-75 Gel filtration chromatography를 통하여 약 123배 순화되었다. Gel filtration 과 SDS-PAGE에 의하여 pl 8.4 protein 은 26lD의 monomer로 확인되었으며 최적 pH는 5.0정도로 조사되었다 26kD protein은 ferulic acid에 대한 Kmdl 0.24mM. Vmax는 14.3μmol/min로 측정되었으며, 본 실험에서 조사된 다른 substrates 에 비하여 affinity나 반응성 모두 가장 높았다. 이러한 결과들은 장미 배양세포의 extracellular peroxidase가 apoplasm에서 ferulic acid의 산화를 촉매하는 기능이 있음을 보여주고 있다. Extracellular peroxidase was purified and characterized to understand the properties of the enzyme from liquid cultured rose(Rosa sp. cv. Paul's Scarlet) cells. Two peroxidase isozymes with pI 8.4 and 8.2 were identified in liquid medium collected from 12 day old cultures by isoelectric focusing electrophoresis and specific staning method. Predominant isoperoxidase with pI 8.4 was subjected to be characterized in this study. Purification of the enzyme with 123 fold was achieved by the acetone precipitation, CM-sepharose ion exchange and Sephadex G-75 gel filtration chromatography. Molecular weight of the pI 8.4 protein was determined to be 26kD and polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecyl sulfate revealed the enzyme as a monomer. The optimum pH of the purified extracellular peroxidase was 5.0 which suggested somewhat acidic pH conditions for enzyme activity in situ. The relatively lower Kn (0.24 mM) and higher Vmax/Km for ferulic acid of the purified enzyme compared with other substrates, guaiacol (Km=16.67mM) or caffeic acid(Km=4.35mM), suggested the high affinity of extracellular peroxidase toward ferulic acid oxidation in apoplasm.

흰쥐 간 Glutathione peroxidase 활성에 미치는 Diallyl disulfide의 영향

허근(Keun Huh),이상일(Sang Il Lee),박종민(Jong Min Park) 대한약리학회 1986 대한약리학잡지 Vol.22 No.2

마늘성분중의 하나인 diallyl disulfide가 간 glutathione peroxidase 활성에 어떠한 영향을 주는가를 관찰하여 다음과 같은 성적을 얻었다. 여러 농도의 diallyl disulfide를 흰쥐에 투여 하였을때 혈청 transaminase의 활성은 변동이 없었으며 또한 간 glutathione의 함량도 변화되지 않았다. 그러나 간 가용성분획의 glutathion peroxidase 활성은 현저히 증가되었다. 시험관 내에서 간 가용성분획의 glutathione peroxidase의 활성은 15μg/㎖ 이상의 diallyl disulfide를 첨가 하였을때 현저히 증가되었으며, 동력학적인 측면에서 관찰하였을때 diallyl disulfide(20μg/㎖)에 의해 Km치는 별 변화가 없었으나 Vmax치는 현저히 증가되었다. 이상의 실험결과에서 마늘 성분 중에 glutathione peroxidase 활성을 증가시키는 성분은 allicin의 분해산물인 diallyl disulfide에 기인된 것으로 사료되며 또한 이 성분은 효소의 기질결합 부위가 아닌 다른 부위에서 효소의 활성을 조절해 줄 것으로 생각되어진다. Glutathione peroxidase might play an important role in the protection of cellular structures against oxidative challange by hydrogen peroxide and several organic hydroperoxides. It is widely accepted that allicin is biological active component of garlic, and allicin is easily degraded to diallyl disulfide and other components. This study was attempted to elucidate the effect of diallyl disulfide on some biological activities. It was observed that the activity of serum transaminase and glutathione level in liver were not changed by the treatment of diallyl disulfide. The liver cytosolic glutathione peroxidase activity was significantly enhanced. Whereas, mitochondrial enzyme activity was slightly increased. In the presence of diallyl disulfide in vitro, V_max value of glutathione peroxidase for hydrogen peroxide was increased. On the other hand, Km value was not changed.