2시간 허혈 후 재관류 시간 경과에 따라 나타나는 혈청 사이토카인의 발현에 미치는 허혈양상화의 효과

진정한(Jeong han Jin),김성재(Sung Jae Kim),서윤경(Younkyoung Seo),김신영(Shinyoung Kim) 대한체질인류학회 2016 대한체질인류학회지 Vol.29 No.2

일시적인 허혈과 수술로 인한 허혈 후 재관류 시 대량의 활성산소가 발생하여 세포에 손상이 발생한다. 이러한 허혈-재관류 손상으로 인해 국소적 손상이 초래되고, 전신적 손상이 발생하기도 한다. 따라서 허혈-재관류 손상을 감소시키기 위한 필요성이 대두되었고 이와 관련해서 허혈 전에 짧은 허혈과 재관류를 반복하는 허혈양상화에 대한 연구가 진행되었다. 허혈양상화는 허혈시 염증반응을 감소시킴으로 허혈 손상에 대해 조직을 보호한다고 알려져 있다. 이에 본 연구에서는 세포조직이 허혈과 재관류 손상에 대해 내성의 기전을 갖게 하면서 조직을 보호한다고 알려진 허혈양상화를 기본으로 하였고, 허혈-재관류 손상에서 나타나는 염증반응에서 중요한 역할을 하는 물질이 사이토카인이기 때문에, 재관류 시간에 허혈양상화 방법론 고찰과 허혈양상화가 사이토카인 발현에 미치는 영향에 대한 상관관계를 분석하였다. 40~45 g 수컷 생쥐의 왼온엉덩동맥을 허혈처치 하였으며 2시간 허혈처치만 시행한 허혈군, 5분간의 짧은 허혈과 재관류를 3회 처치한 허혈양상화군, 허혈양상화 처치 후 2시간 허혈을 시행한 허혈양상화 및 허혈군으로 하는 실험군을 구성하였고 각 실험군에서의 처치 후 비교를 위한 재관류 시간은 30분, 1시간, 2시간, 4시간을 시행하였다. 연구결과는 다음과 같다. 첫째, 허혈군이 허혈양상화군과 허혈양상화 및 허혈군과 비교했을 때 친염증성 사이토카인 IL-1β의 수치가 가장 높게 발현되었다 (p<.001). 둘째, 항염증성 사이토카인인 IL-4는 허혈군, 허혈양상화 및 허혈군과 비교했을 때 허혈양상화군에서 가장 높게 발현되었다 (p<.001). 셋째, 항염증성 사이토카인인 IL-10은 허혈군, 허혈양상화 및 허혈군과 비교했을 때 허혈양상화군에서 가장 높게 발현되었다 (p<.001). 위의 결과들을 종합했을 때 정도에 따라 차이는 있지만, 허혈양상화 처치는 허혈군과 허혈양상화군보다 허혈양상화 및 허혈군의 친염증성 사이토카인 IL-1β를 감소시켰고, 항염증성 사이토카인 IL-4와 IL-10은 허혈양상화군에서 허혈군과 허혈양상화 및 허혈군보다 증가하였다. The large volume of reactive oxygen species are generated during reperfusion after transient or postprocedural ischemia, which leads to cell injury. This ischemia-reperfusion (IR) injury may cause local and even systemic injuries. Thus, the need to reduce the IR injury has been highlighted and in this regard studies have demonstrated the ischemic preconditioning (IP) in which short ischemia and reperfusion are repeated before ischemia. Such IP is known to protect the tissues from IR injury by reducing inflammation response during ischemia. Thus, this study was based on IP known to protect the tissue with developing the mechanism of resistance to ischemia and reperfusion injury in cellular tissue. As the substance that plays an important role in the inflammatory response during IR injury is cytokines, this study was intended to review and discuss the methodologies of IP as well as to analyze the correlation of its effects on the expression of cytokines. Left common iliac artery in male mice of which weight was from 40 g to 45 g, was treated for ischemia. The animal groups consisted of ischemia (IC) group receiving 2-hour ischemic treatment alone; IP group receiving short 5-minute ischemia and reperfusion treatments repeated three times; and, ischemic preconditioning-ischemia (IP-IC) group receiving IP treatment followed by 2-hour ischemic treatment. Following these treatments in each group, reperfusion for intergroup comparisons was carried out at 30 minutes, and 1, 2 and 4 hours. The results of this study were as follows: First, the expression level of pro-inflammatory cytokines, IL-1β was the highest in IC group receiving 2-hour ischemic treatment alone (p<.001). Second, the expression level of anti-inflammatory cytokine, IL-4 was the highest in the IP group (p<.001). Third, the expression level of anti-inflammatory cytokine, IL-10 was the highest in the IP group (p<.001). In conclusion, even though the results had the degree of difference, the expression level of pro-inflammation cytokine, IL-1β in IC group was significantly lower than that in IP group, and the expression levels of antiinflammatory cytokines, IL-4 and IL-10 in IP were significantly higher than those in IC group and IP-IC group.

왼온엉덩동맥 허혈 후 재관류 시간경과에 따른 생쥐의 혈청 내 친염증성 cytokine의 변화

박경신(Kyung shin Park),김성재(Sung Jae Kim),서윤경(Younkyoung Seo) 대한체질인류학회 2016 해부·생물인류학 (Anat Biol Anthropol) Vol.29 No.1

허혈 재관류 손상은 허혈이 이루어진 후 재관류되면서 일어난다. 허혈 재관류 손상의 주요 원인은 활성산소기와 활성화된 면역세포가 분비하는 cytokine이다. Cytokine은 감염이나 면역반응, 염증 등의 반응을 조절하는 세포 사이의 신호전달물질로, 염증반응을 증가시키는 것을 친염증성 cytokine이라 한다. 본 실험에서 저자들은 허혈후 재관류 경과에 따른 친염증성 cytokine인 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, eotaxin, MCP-1, MDC, MIP-1α, RANTES, TARC, IFNγ의 변화를 알아보았다. 12주령의 수컷 생쥐를 이용하여 정상대조군과 2시간 허혈군, 4시간 허혈군, 6시간 허혈군으로 구분하였고, 총 96마리의 생쥐를 사용하였다. 허혈처치는 왼온엉덩동맥을 혈관집게를 이용하여 차단하였고, 각 허혈군은 재관류 경과에 따라 0시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간으로 재분류하였다. 재관류 시간에 따라 생쥐를 마취시킨 후 심장에서 혈액을 채취하였다. 혈청을 분리한 후 ELISA 분석방법을 이용하여 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, eotaxin, MCP-1, MDC, MIP-1α, RANTES, TARC, IFNγ의 농도를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 13개의 cytokine 농도는 허혈시간에 따라 그리고 재관류 시간에 따라 유의한 차이가 있었다. 허혈 2시간군에서 IL-1α와 IL-3는 정상대조군보다 유의성 있게 증가되었고, 재관류 후 MIP-1α를 제외한 모든 cytokine들은 증가하였으며, MCP-1과 TARC은 재관류 16시간에 가장 높은 농도로 관찰되었다. 허혈 4시간군에서 TARC만이 정상대조군보다 유의성 있게 증가되었으며, 재관류 후 모든 cytokine들은 재관류 4시간 이후에 감소하는 경향으로 관찰되었다. 허혈 6시간군에서 IL-2, IL-3, MCP-1, TARC은 정상대조군보다 유의성 있게 증가되었고, 재관류 16시간에 IL-3와 MCP-1이 유의성 있게 증가되었다. 이상의 결과를 종합하면, 허혈은 친염증성 cytokine을 정상대조군보다 증가시키는 것을 알 수 있었고, 특히 2시간과 6시간 허혈군에서 관찰된 IL-1α, IL-3, MCP-1, TARC은 재관류 후기까지 비교적 높은 농도로 유지되는 것을 알 수 있었다. Ischemia-reperfusion injury arises from the restoration of blood supply after ischemia. Both reactive oxygen species and various cytokines produced by activated immune cells are the primary causal risk factors for ischemic injury. Cytokines are intercellular signaling substances for regulating any infection, immune reactions and inflammation, and pro-inflammatory cytokines adversely affect any diseases through an increase in inflammatory reaction. This study was conducted to investigate whether the periods of reperfusion after ischemia result in any changes of pro-inflammatory cytokines in the serum, including IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, Eotaxin, MCP-1, MDC, MIP-1α, RANTES, TARC, IFNδ. A total of 96 male mice aged at 12 weeks was used in this study, and the groups of ischemia were divided into the following three different groups: 2-hour, 4-hour, and 6-hour ischemia groups. For the object of ischemic injury, the left common iliac artery was clamped by vascular clamp, each ischemia group was subdivided into 5 different groups according to the periods of reperfusion: 0-, 2-, 4-, 8-, and 16-hour reperfusion time. Blood samples after general anesthesia were collected from the mice hearts, and the serum was separated from them. The concentration of pro-inflammatory cytokines (IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, Eotaxin, MCP-1, MDC, MIP-1α, RANTES, TARC, IFNδ) in the serum was measured by ELISA, and the following results were acquired. The concentrations of the 13 pro-inflammatory cytokines were significantly different in accordance with the periods of ischemia and the reperfusion time. In 2-hour ischemia group, IL-1α and IL-3 were increaed compared to normal control group, and 12 cytokines were increased followed by reperfusion except for MIP-1α. MCP- 1 and TARC were expressed as the highest concentration in the 16-hour reperfusion time. In 4-hour ischemia group, TARC was significant differences with normal control group, and the concentration of 13 cytokines were decreased after 4-hour reperfusion time. In 6-hour ischemia group, IL-2, IL-3, MCP-1 and TARC were increased, compared to normal control group, and IL-3 and MCP-1 were increased in 16-hour reperfusion time. To sum up, ischemia increased the pro-inflammatory cytokines compared to normal control group and in the 2-hour and 6-hour ischemia groups, IL-1α, IL-3, MCP-1 and TARC were increased until the late reperfusion time.

갑상선 호르몬이 잡견 폐장의 허혈-재관류 손상에 미치는 영향

김영태,성숙환 대한흉부심장혈관외과학회 1999 Journal of Chest Surgery (J Chest Surg) Vol.32 No.7

Background: Ischemia-reperfusion injury is one of the major contributing causes of early graft failure in lung transplantation. It has been suggested that triiodothyronine (T3) may ameliorate ischemia-reperfusion injury to various organs in vivo and in vitro. Predicting its beneficial effect for ischemic lung injury, we set out to demonstrate it by administering T3 into the in situ canine ischemia-reperfusion model. Material and Method: Sixteen adult mongrel dogs were randomly allocated into group A and B. T3 $(3.6\mug/kg)$ was administered before the initiation of single lung ischemia in group B, whereas the same amount of saline was administered in group A. Ischemia was induced in the left lung by clamping the left hilum for 100 minutes. After reperfusion, various hemodynamic parameters and blood gases were analyzed for 4 hours while intermittently clamping the right hilum in order to allow observation of the injured left lung function. Result: Arterial oxygen partial pressure $(PaO_2)$ decreased 30 minutes after reperfusion and recovered gradually thereafter in both groups. In group B the decrease of $PaO_2$ was less marked than in group A. The recovery of $PaO_2$ was faster in group B than in group A. The differences between the two groups were statistically significant from 30 minutes after reperfusion $(125\pm34$ mmHg and $252\pm44$ mmHg, p<0.05) until the end of the experiment $(178\pm42$mmHg and $330\pm37$ mmHg, p<0.05). The differences in the arterial carbon dioxide pressure, airway pressure and lung compliance showed no statistical significance. The malondialdehyde (MDA) level, measured from the tissue obtained 240 minutes after reperfusion, was lower in group B $(0.40\pm0.04\mu$M) than in group A $(0.53\pm0.05\mu$M, p<0.05). The ATP level of group B $(0.69\pm0.07\mu$M/g) was significantly higher than that of group A $(0.48\pm0.07\mu$M/g, p<0.05). The microscopic exami nation revealed varying degrees of injury such as perivascular neutrophil infiltration, capillary hemorrhage and interstitial congestion. There were no differences in the microscopic findings between the two groups. CONCLUSION T3 has beneficial effects on the ischemic canine lung injury including preservation of oxygenation capacity, less production of lipid peroxidation products and a higher level of tissue ATP. These results suggest that T3 is effective in pulmonary allograft preservation. 배경: 여러 장기의 생체 내 혹은 생체 외 실험에서 삼요드티로닌(triiodothyronine; T3)이 장기의 허혈-재관류 손상을 줄이는 효과가 있을 것으로 보고되고 있다. 이 연구에서는 삼요드티로닌을 투여하여 폐장 이식 초기 에 이식 실패의 가장 중요한 원인인 폐장 허혈-재관류 손상을 줄일 수 있을 것으로 가정하고 폐 허혈-재관류 손상을 평가할 수 있는 동물 실험 모델을 통하여 이를 증명하고자 하였다. 대상 및 방법: 체중 15~20 kg의 잡견 16마리를 무작위로 두 군으로 나눈 뒤, 대조군인 A군에는 식염 수를 정맥 주사하고 실험군인 B군에는 일측 폐 허혈 유발 전에 삼요드티로닌 $3.6\mu$g/kg을 정맥 주사하였으며 주사량 (ml)은 두 군에서 같게 하였다. 좌측 폐문부를 차단하여 좌측 폐 허혈을 100분간 유발시킨 후 재관류시켰고, 재관류 후 4시간 동안 우측 폐문부를 간헐적으로 차단하면서 좌측 폐의 가스 교환능, 혈역학적 변수, 호흡 역학적 변수를 측정하였다. 실 험 종료 후 폐 조직 일부를 생검하여 폐 조직 수분 함량, 지방 산화물(malonedialdehide; MDA)과 조직 내 ATP양을 측정하고, 광학 현미경 소견을 관찰하였다. 결과: 동맥혈 산소 분압은 두 군에서 모두 재관류 30분에 감소하였다가 서서히 회복하는 양상을 보였으며 재관류 30분에 A군은 $125\pm34$ mmHg, B군은 $252\pm44$ mmHg, 실험을 종료한 4시간에 A군은 $178\pm42$ mmHg, B군은 $330\pm37$ mmHg으로 전 과정을 통해 실험군인 B군에서 내내 높았다(p<0.05). 동맥혈 이산화탄소 분압, 폐혈관 저항, 기관내압 및 폐 탄성도 등 호흡 역학적 변수, 그리고 폐 조직 수분 함량은 두 군간에 차이가 없었다. 조직 내 MDA양은 A군$(0.53\pm0.05mu$M)에 비해 B군$(0.40\pm0.04\mu$M)에서 낮았다 (p<0.05). ATP양은 A군에서$0.48\pm0.07\mu$M/g, B군에서 $0.69\pm0.07\mu$M/g으로 B군에서 높았다(p<0.05). 폐 생검 조직의 광학 현미경 소견은 혈관 주위 호중구 침윤, 모세 혈관 출혈과 간질 내 울혈 등이 관찰되었고 두 군간의 차이는 없었다. 결론: 이상의 결과에서 삼요드티로닌이 폐장의 허혈-재관류 손상 후 산소 교환능을 개선시키고, 조직 내 지방 산화물의 생성을 줄이며 조직 ATP를 증가시킴으로써 이식폐 보존에 유용하게 이용될 수 있음을 입증하였다.

Effects of Inducible NOS Inhibition on Motor Function Recovery After Sciatic Nerve Ischemia and Reperfusion in Rats

Sang-Jin Shin(신상진),Soo Bong Hahn(한수봉) 대한정형외과학회 2005 대한정형외과학회지 Vol.40 No.5

목적: 말초 신경의 허혈-재관류 손상에서 산화질소 역할에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나 세 종류의 산화질소 생성효소 중 유발 산화질소 생성효소의 말초 신경 손상에서의 작용은 여러 가지 다양한 결과들이 보고되고 있다. 본 논문은 백서 좌골 신경의 허혈-재관류 손상에서 유발 산화질소 생성효소 억제가 운동 기능 회복에 미치는 영향에 관하여 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 170마리의 백서를 유발 산화질소 생성효소 특이 억제재인 1400W를 투여한 실험군과 증류수를 투여한 대조군으로 나누었다. 각 군 백서의 좌골 신경에 2시간 동안 특별히 고안된 기계로 압박을 가해 허혈을 유발한 후 42일까지의 재관류 기간 동안 운동 기능 회복, 허혈 신경의 조직학적 검사, 유발 산화질소 생성효소의 mRNA와 단백질 발현 변화를 관찰하였다. 결과: 좌골 신경 운동 기능 지수로 측정한 운동 기능은 재관류 후 11일부터 실험군에서 의미 있게 빠르게 회복되었다. 특히 재관류 18일에 두 군 사이에 가장 큰 차이를 보였으며(실험군; -46.8, 대조군; -29.4) 재관류 28일 후에는 차이가 없었다. 전체 회복 속도는 실험군이 약 일주일 정도 빠른 회복을 나타내었다. 허혈 신경의 조직학적 소견은 실험군에서 대조군보다 빠른 신경 섬유 회복 및 축삭 퇴행 지연이 관찰되었다. 유발 산화질소 생성효소의 mRNA와 단백질 발현은 재관류 첫 3일 동안 정상 발현량보다 의미있게 증가하였다가 감소하였다. 1400W는 증가된 유발 산화질소 생생효소 mRNA와 단백질 발현을 재관류 7일까지 통계학적으로 의미 있게 감소시켰다. 결론: 말초 신경 허혈 후 유발 산화질소 생성효소의 재관류 초기 억제가 유발 산화질소 생성효소 mRNA와 단백질 발현을 감소시켜 재관류 전 기간 동안 신경을 빠르게 회복시켰다. 유발 산화질소 생성효소의 억제가 말초 신경 허혈-재관류 손상 예방 및 치료의 한 방법이 될 수 있을 것으로 사료된다. Purpose: Introduction: Nitric oxide (NO) is known to play an important role in ischemia and reperfusion (I/R) injuries in the peripheral nerve. However, among various NO synthases (NOS), the effects of inducible NOS (iNOS) on peripheral nerve I/R injuries are still under debate. This study presents the influence of iNOS on the regeneration of crushed peripheral nerve in rats. Materials and Methods: One hundred and seventy female Sprague-Dawley rats (body weights 175-200 g) were randomly divided into two groups to receive an injection of 1400W (iNOS specific inhibitor, 3 ㎎/㎏) or the same volume of purified water. One sciatic nerve of each rat (10 ㎜ in length) was subjected to a 100-g crush load for 2 hours to induce ischemia. Motor functional recovery by walking track test and histology of the crushed nerve in the two groups were evaluated at different reperfusion time (3 hours, and 1, 3, 7, 11, 14, 21, 28, 35, and 42 days). mRNA and protein levels for iNOS in the nerve were measured. Results: Sciatic functional index (SFI) for motor functional recovery in the 1400W treated group improved at a significantly faster rate than that in the control group from day 11 after the ischemia. The difference peaked at day 18 (-46.8 in the 1400W treated group and -29.4 in the control group) and lasted until day 28. Histologic results were comparable with motor functional results. Histological observation revealed less axonal degeneration and earlier regeneration of nerve fibers in the 1400W treated rats than in the control rats. iNOS mRNA and protein were upregulated during the first 3 days of reperfusion, and iNOS inhibitor significantly attenuated the increased iNOS during the early phase of the reperfusion until 7days. Conclusion: Inhibition of iNOS during the regeneration of the ischemic nerve influenced mRNA and protein level early in the reperfused period and assured faster functional recovery faster than in the untreated group. These results suggest that early administration of 1400W has therapeutic potential for the treatment of I/R injury.

뇌허혈 손상시 아그마틴이 기질분해효소의 발현에 미치는 영향

김재환(Jae Hwan Kim),이용우(Yong Woo Lee),김재영(Jae Young Kim),이원택(Won Taek Lee),박경아(Kyung Ah Park),이종은(Jong Eun Lee) 대한해부학회 2008 Anatomy & Cell Biology Vol.41 No.1

아그마틴은 알기닌 탈탄산효소에 의해 알기닌으로부터 생성되는 일차아민으로 포유류의 뇌에 존재함이 밝혀졌다. 최근 여러연구자에 의해 아그마틴은 일산화질소 생성효소(NOS)의 발현과 활성을 조절해 일산화질소의 생성을 조절하는 것으로 보고되었으며, 중추신경계 손상시 신경보호작용이 있는 것으로 확인되었다. 본 연구에서는 대표적인 중추신경계 손상인 뇌허혈 손상시 아그마틴이 재관류 손상시발현되는 세포외 기질분해효소인 MMP2와 MMP9의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 뇌허혈 손상을 2시간동안 일으킨 후 재관류와 동시에 아그마틴을 100 mg/kg의 농도로 복강 내에 투여하였다. 재관류 22시간 후에 동물을 희생하여 그 결과를 확인하였다. 아그마틴은 뇌허혈-재관류 손상시 발현되는 MMP2와 MMP9의 발현을 감소시켰다. 이러한 현상은 손상핵심부위인 대뇌피질, 선조부위뿐만 아니라 손상주변부위에서도 확인할 수 있었다. 특히 혈관부위 에서도 MMP2와 MMP9의 발현의 감소를 확인하였다. 아그마틴의 발현정도를 알아보기 위한 형광면역염색에서도 대뇌피질부위는 크게 차이가 나지 않지만 선조와 손상주변 부위는 아그마틴 처리군에서 아그마틴의 발현이 증가됨을 확인하였고, 역시 혈관부위에서 아그마틴이 상대적으로 강하게 발현됨을 알 수 있었다. 아그마틴은 여러 일산화질소 생성효소 (NOS) 중에서 nNOS와 iNOS의 발현은 줄이고, eNOS의 발현은 줄이는 것으로 보고 되었으며, MMP2와 MMP9은 nNOS와 iNOS에 의해 생성되는 일산화질소에 의해 발현이 증가되는 한편 eNOS에 의해 생성되는 일산화질소에 의해서는 그 발현이 감소하는 것으로 보고되었다. 이상의 보고들을 볼 때 아그마틴은 뇌허혈 손상시 nNOS와 iNOS를 통한 일산화질소의 생성을 감소시켜 MMP2와 MMP9의 발현을 줄이며, eNOS를 통한 일산화질소의 생성을 증가시켜 MMP2와 MMP9의 발현을 감소시키는 것으로 생각된다. Agmatine is a primary amine formed by decarboxylation of L-arginine synthesized in the mammalian brain. Recent studies have shown that agmatine is neuroprotective in models of trauma and ischemia. The purpose of this study was to evaluate the effect of agmatine on the expression of MMP2 and MMP9, which are expressed in reperfusion injury following cerebral ischemia. Mice were subjected to 2 h middle cerebral artery occlusion and 22 h reperfusion. Agmatine (100 mg/kg) was administered intraperitoneally at the start of reperfusion. Agmatine treatment significantly reduced the immunoreactivity of MMP2 and MMP9 in the cortex, striatum, and penumbra on the ipsilateral side. The immunoreactivity of MMP2 and MMP9 was markedly lower in blood vessels of the agmatine-treated group than in the experimental control group. Immunoblot analysis showed that agmatine treatment decreased the expression of MMP2 and MMP9. After exogenous agmatine administration, the expression of agmatine was higher in the striatum and penumbra of the agmatine-treated group than in the experimental control group. The fluorescence intensity was markedly greater in blood vessels in the agmatine-treated group than in the experimental control group. These data suggest that agmatine might decrease the expression of MMP2 and MMP9 by regulating NOS activity, and thereby modulating NO synthesis.

토끼 폐장 분리관류 모형에서 Low Potassium Dextran 용액에 Cyclic Adenosine Monophosphate와 Nitric Oxide의 첨가가 폐보존에 미치는 영향

조덕곤,조규도,김영두,곽문섭 대한흉부심장혈관외과학회 2001 Journal of Chest Surgery (J Chest Surg) Vol.34 No.3

배경: 이식폐의 보존 및 재관류 동안 cyclic adenosine monophosphate(cAMP)와 nitric oxide(NO)는 폐혈관 내 순환조절을 유지하는데 있어 중심적인 역할을 한다. 그러나 내치세포내의 cAMP와 NO 모두 허혈-재관류 과정 동안에 현저하게 감소한다. 이에 저자는 low potassium dextran(LPD) 폐조본액에 cAMP의 유사체인 dibutyry1 cAMP(db-cAMP)와 NO의 공여물질인 nitroglycerin(NTG)을 첨가하여 이들의 폐보존 효과를 알아보고, 이들은 첨가한 폐보존액 들의 효과를 비교하였다. 대상 및 방법: 토끼 폐장 분리관류 모형에 실험군은 각각 6마리씩 4개군으로 단순 LPD 페보존액만 사용한 경우(I군), LPD 용액에 NTG 만 참가한 경우(II군), cAMP 만 첨가한 겨우(III군) 그리고 두가지 모두를 첨가한 경우는 IV군으로 분류하였으며, 폐보존액이 주입된 심폐블록은 영상 1$0^{\circ}C$에서 24시간 동안 보관한 다음 100% 산소농도에서 기계호흡을 하면서 신선 정맥혈로 30분 동안 재관류를 시행하였다. 재관류폐의 평가를 위해 폐기능 및 폐부종 정도를 정량 측정하였으며, 유출로 혈액으로부터 tumor necrosis factor $\alpha$(TNF-$\alpha$)와 간접적인 NO의 총량을 알기 위해 nitrite/nitrate의 양을 측정하였다. 또한 재관류가 끝난 후 광학 및 전자현미경학적 소견을 관찰하였다. 결과: 모든 실험군 중 제 IV군 의 폐보존 능력이 가장 우수하였으나, 제 II, III, IV군 사이는 통RP적으로 유의한 차이가 없었다. 제 I군은 제 II, III, IV군들에 비해 유의하게 폐기능이 가장 나쁘고 폐부종 정도가 가장 심했다(p<0.05). 제 II군은 제 III군에 비해 더 좋은 폐기능을 보였고, 폐부종 정도가 덜 하였으나 통계적은 유의성은 없었다. TNF-$\alpha$ 는 제 IV 군이 Irns에 비해 유의하게 분비량이 적었다. (p<0.05). 총 NO의 양은 제 II군과 IV 군이 제 I 군과 III군보다 유의하게 높았으나(p<0.001), 제 II군과 IV군, 제 I군과 III군 사이 비교에서 유의한 차이는 없었다. 또한 제 I 군과 III군에서는 시간이 지남에 따라 유의하게 NO의 양이 점차 감소하였다. (p<0.05). 광학 및 전자현민경 소견상 폐포 및 폐혈관 구조가 제 II, III, IV 군이 I 군에 비해 더 잘 보존되어있었다. 결론: LPD 폐보존액에 db-cAMP 및 NTG의 첨가는 폐보존 효과가 모두 우수함을 확인하였고 이들의 폐보존 효과 차이는 거의 없음을 알수 있었다. 그렇지만 이들의 병합사용이 폐혈관 항상성을 더 잘 유지시킬 수 있고 허혈-재관류 손상을 줄여 폐보존 효과를 높일 수 있을 것이라고 기대된다.

배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 시험관실험모델

홍정숙(Jeong Sook Hong),성훈기(Hoon Ki Sung),송인환(In Hwan Song),김주영(Joo Young Kim),지대림(Dae Lim Jee),성언기(Eon Gi Sung) 대한해부학회 2003 Anatomy & Cell Biology Vol.36 No.3

본 실험은 생체의 특성을 잘 유지할 수 있는 별큰포식세포의 배양법을 확립하고, 배양된 별큰포식세포를 이용하여 간 의 허혈-재관류 과정에서 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 재현할 수 있는 시험관내 실험모델을 제작하여 다음의 결과 를 얻었다. 별큰포식세포의 분리에서 collagenase의 관류, stainless 그물의 통과, Percoll gradient centrifugation 및 세포가 배양용기에 부착하는 시간의 차이를 이용한 분별부착법 등의 일련의 조작으로 90% 이상의 순수한 별큰포식세포를 얻을 수 있었다. 흰쥐 1개의 간에서 1~5×107개의 별큰포식세포를 얻었고, 다른 세포의 과다증식없이 별큰포식세포 배양을 10일 정도 유 지할 수 있었다. 배양된 별큰포식세포의 탐식능력은 배양액에 첨가된 latex beads의 탐식정도로 측정하였는데, 그 수가 한 개에서 수십 개로 다양하였다. 크고 둥근 모양의 별큰포식세포가 많은 latex beads를 탐식하였고 작거나 불규칙한 모양의 세포는 탐식 능력이 떨어져, 생체에서의 별큰포식세포의 다양성에 따른 탐식능력의 차이가 시험관에서도 유지되었다. 배양된 별큰포식세포의 무산소-산소재공급 처리한 실험군에서는 70.2%의 세포가 latex beads를 탐식하였고 latex beads 를 탐식한 세포들 중 57.5%의 세포가 5개 이상의 latex beads를 탐식하여 대조군의 48.9%와 44.3%에 비교하여 유의한 증 가를 보여 (p⁄0.01), 허혈-재관류 후에 발생되는 별큰포식세포의 활성화를 직접적으로 설명할 수 있는 결과였다. 결론적으로 본 실험에서 배양된 별큰포식세포는 탐식기능에서 생체의 특성을 잘 유지하였고, 이를 이용한 무산소-산소 재공급 시험관모델은 간의 허혈-재관류 손상에서 별큰포식세포의 역할을 이해하는데 적합한 것으로 생각된다. The aims of this study were to describe a reproducible method for the isolation, purification and primary culture of rat Kupffer cells, and were to develop in vitro system which could provide a tool for the study of ischemia-reperfusion injury. Kupffer cells were isolated following sequential collagenase digestion of the liver by perfusion and enrichment of a nonparenchymal cell fraction by a double-densities gradient centrifugation step using Percoll and were selected by allowing them to adhere to culture vessel for 2 h at 37�C under 5% CO2. The purity of obtained Kupffer cell was about 90% assessed by the phagocytosis of 3 μm latex beads. This method for Kupffer cell isolation resulted in yields of 1~5 ×107 Kupffer cells per liver and Kupffer cells were preserved in maintenance cultures for 10 days. The phagocytic capacity of cultured Kupffer cells was measured according to the amount of latex beads incorporated into the cytoplasm. Larger round Kupffer cells in the culture had higher phagocytic capacity compared with smaller round or irregular shaped Kupffer cells. The different phagocytic capacity of Kupffer cells which was dependent on size and shape in vivo was well preserved during culture. The experimental group of Kupffer cells in culture were sequentially treated with ischemia and reperfusion at 1h and 30 min. The ratio of Kupffer cells having latex beads in their cytoplasm was significantly increased compared with control (p⁄0.01). This result was able to explain the Kupffer cells’ activation after ischemia-reperfusion injury in vivo. In conclusion, Kupffer cells in this culture well resembled the cells in vivo and this in vitro model could provide a valuable tool for the study of Kupffer cells with a key role in pathophysiology of ischemia-reperfusion injury.

허혈-재관류 손상 후 흰쥐 간세포 생존능의 평가

박상환(Sang-Hwan Park),윤성수(Sung-Su Yun),이동식(Dong-Shik Lee),김홍진(Hong-Jin Kim),최준혁(Joon-Hyuk Choi),김종연(Jong-Yeon Kim) 대한외과학회 2007 Annals of Surgical Treatment and Research(ASRT) Vol.73 No.1

Purpose: Liver cell damage after ischemia and reperfusion injury has been a major cause of death after liver surgery. Yet there have been no exact and practical guidelines for assessing liver cell damage after ischemia and reperfusion injury. The aim of this study was to estimate the liver cell viability after ischemia and reperfusion injury. Methods: A 70% partial liver occlusion model with employing Spraque Dawley Rats was used. The ATP content of the liver tissue, the palmitic acid metabolic rate and the histologic change (H/E, TUNEL stain) were all measured at 30 minute intervals to assess liver cell viability during 120 minutes of ischemia. At 24 hours reperfusion after 30, 60 and 120 minutes ischemia, the same parameters and the AST/ALT level in the blood were measured. Results: The ATP content was decreased below 20% compared to normal liver after ischemia, but there were no significant changes in the histology and the palmitic acid metabolic rate during 120 minutes ischemia. At 24 hours reperfusion after 30, 60 and 120 minutes ischemia, the ATP content was decreased to around 50% in all the groups and the palmitic acid metabolic rate was decreased 90.9±2.4%, 80.0±5.3% and 79.1±7.7%, respectively, compared to the control liver. But histologic change was not as great as the change in the ATP content and the palmitic acid metabolic rate. Conclusion: Judging by these results, liver has relatively good tolerance during ischemia, but after reperfusion, the liver showed damage depending on the duration of ischemia. This study might be very helpful as a guide line of liver damage after ischemia and reperfusion in both clinical practice and basic research.

신장 허혈 재관류 손상에 미치는 Ethyl Pyruvate의 효과

정구용(Ku-Yong Chung),정규영(Gyu Young Jeong),안형준(Hyung Joon Ahn),주만기(Man Ki Ju),장혜경(Hye Kyung Chang),이우정(Woo Jung Lee),한평림(Pyung-Lim Han),김유선(Yu Seun Kim) 대한외과학회 2007 Annals of Surgical Treatment and Research(ASRT) Vol.72 No.5

Purpose: Reactive oxygen species (ROS) significantly contribute to ischemia-reperfusion injury, and are also associated with the gradual loss of renal function and renal failure following renal transplantation. Pyruvate is an endogenous antioxidant, but its use as a therapeutic agent for treating conditions mediated by oxidative stress is limited due to its poor stability in solution. However, ethyl pyruvate (EP), a soluble pyruvate derivative, has far greater stability than pyruvate; thus, may serve as a practical pyruvate precursor. Therefore, the ability of EP in the prevention of renal ischemia- reperfusion injury was assessed. Methods: Sprague-Dawley rats (n=54) were subjected to 40 minutes of renal warm ischemia. The animals were divided into three groups: the sham group without warm ischemia (n=18), the EP group (n=18, EP given before ischemia), and the ischemic control (n=18). The serum levels of creatinine and TNF-α were measured 1, 3 and 5 days after induction of ischemia. The expression of high mobility group box-1 (HMGB-1), a delayed inflammatory mediator, was also assessed by Western blot of renal specimens. Results: In the EP group, late improvements in the serum levels of creatinine and TNF-α were observed in comparison with the ischemic control. Based on this delayed effect, the expression of HMGB-1 was assessed in renal tissue. The HMGB-1 expression increased over time during the ischemia process, but EP suppressed this expression 3 and 5 days after renal ischemia-reperfusion injury. Conclusion: These results have demonstrated, for the first time, that EP ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. EP attenuates the renal ischemia-reperfusion injury, at least in part, by suppressing the expression of HMGB-1, a late mediator of delayed inflammation.

Mitochondrial Permeability Transition Pore와 허혈-재관류 손상으로부터의 심근보호작용

이종화,심연희 대한의사협회 2009 대한의사협회지 Vol.52 No.10

Opening of mitochondrial permeability transition pore (mPTP) was found to have a critical role in cell death from ischemia/reperfusion (I/R) injury experimentally in the late 1980’s. Thereafter, tremendous efforts have been made to define the molecular composition of mPTP and underlying mechanisms of its opening. mPTP opening, so far, has been demonstrated with the conformational changes of the mitochondrial protein components including cyclophilin-D, adenine nucleotide translocase, and voltage-dependent anion channel, which were induced by the modification of the levels of Ca2+, phosphate, mitochondrial membrane potential, intracellular pH and adenine nucleotide. At present, genetic modulation of the expression of protein components are being used in the investigation of its properties, presenting novel mechanisms of mPTP opening, including phosphate carrier. For therapeutic intervention, cyclosporin A and its analogues were first to be demonstrated to inhibit the opening of mPTP, affecting cyclophilin-D. There are numerous pharmacological substances that have direct or indirect effects on mPTP opening, including bongkrekic acid, reactive oxygen species scavengers, calcium channel blockers, and Na+/H+ exchanger-1 inhibitors, but only cyclosporin A was clinically tried to limit the myocardial infarction. Conditioning interventions, ischemic or anesthetic, have also been shown to be effective in limiting the detrimental effects of I/R injury. These interventions are commonly related to specific receptors on cell membrane and then signal transduction pathway consisting of many protein kinases, which eventually lead to mitochondria. And being presented are experimental evidences that inhibition of mPTP opening is a primary mechanism of these conditioning interventions. In conclusion, mPTP opening is now presented as primary mechanism and therapeutic target of I/R injury, but precise mechanism and standardized treatment method are needed to be clarified.