신규 수입 승인 6개 유전자변형작물의 검출기법 개발

설민아,조범호,최원균,신수영,엄순재,김일룡,송해룡,이중로,Seol, Min-A,Jo, Beom-Ho,Choi, Wonkyun,Shin, Su Young,Eum, Soon-Jae,Kim, Il Ryong,Song, Hae-Ryong,Lee, Jung Ro 한국식물생명공학회 2017 식물생명공학회지 Vol.44 No.1

일반적으로 유전자를 재조합하는 생명공학기술이 널리 이용되고 있는 것은 유전자변형 작물 분야이다. LM 제품에 대한 의존도가 높아짐에 따라 한국에서는 LMO의 안전성에 대한 우려가 지속적으로 증가하고 있다. 따라서, 우리는 자연환경 내 비의도적으로 방출된 LMO를 판별할 수 있는 검출기법을 확립하였다. JRC 정보를 토대로 6개 LM 이벤트(캐놀라 1, 옥수수 1, 콩 4개)의 유전자를 검출할 수 있는 PCR 조건을 확립하였다. 각 LM 시료에서 genomic DNA를 분리하였고, 이벤트 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR 실험을 수행하였다. 또한 자체적으로 확립된 검출법에 의해 모든 LMO의 이벤트 특이적 유전자가 검출되었다. LM 유전자의 삽입 위치를 분석하기 위해 PCR 생성물을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이 결과는 LM 이벤트의 특이적인 유전자를 효율적으로 검출할 수 있음을 나타낸다. 게다가 본 연구결과 확립된 검출기법은 자연환경 내 LM 작물의 모니터링 및 사후 관리에 활용될 것이다. Living modified crops are genetically modified living organisms and are widely used in biotechnical research and desired goods. As the reliance on LM products, concerns about safety of LMOs have been continuously increased in South Korea. We established the detection methods for unintentional released LMOs in environmental conditions. To detect six LM event genes of 1 canola, 1 maize and 4 soybeans, PCR conditions were based upon consideration of the Joint Research Centre information. Genomic DNAs were isolated from LM samples and PCR analysis were performed using each event-specific primer pair. Event-specific genes of all events were efficiently recognized by our methods. To investigate the insertion site of LM genes in each genome, we verified PCR product sequence by DNA sequencing. These results suggest that the LM event-specific gene amplification can be efficiently developed. In addition, our detection method is fit for monitoring and post-management of LM crops in the environment.

2014년 경기지역 유전자변형 옥수수 모니터링 및 발견현황

신수영,문정찬,최원균,김일룡,조범호,이중로,Shin, Su Young,Moon, Jeong Chan,Choi, Wonkyun,Kim, Il Ryong,Jo, Beom-Ho,Lee, Jung Ro 한국식물생명공학회 2018 식물생명공학회지 Vol.45 No.1

국내에서 LM 작물의 재배는 승인 된 바 없으나 식품용 및 사료용으로 LM 작물이 수입되고 있으며 LM 작물의 국내 수입량은 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 본 연구는 2014년 경기 지역의 LM 옥수수 유출여부를 모니터링 하기 위해 수행되었으며 채집된 의심시료는 단백질 검정 분석법과 중합효소 연쇄반응을 통해 분석하였다. 경기 지역의 항만, 운송로, 사료공장 및 축산농가 등 총 169개 지점을 조사하였고 총 44개의 LM 옥수수 의심시료를 채집하였다. 단백질 검정 분석법으로 4개의 양성반응 시료를 확인하였고 동일지점의 시료는 혼합하여 총 3개의 시료에 대해 프로모터 스크리닝과 이벤트 특이적 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 의심시료 모두 LM 옥수수로 확인하였다. 본 연구의 결과는 국내 자연환경에서 LM 옥수수의 유출 현황 파악과 자연 생태계로 LM 옥수수의 유출을 예방하기 위해 자연생태계 모니터링이 매우 중요하다는 것을 뒷받침한다. In South Korea, LM crops are not allowed to grow locally, but have been allowed to be imported as food and feed purposes. Currently, the typical LMO imports are continuously increasing in the region of South Korea. In 2014, we carried out a review of the environmental release monitoring of LM maize (Zea mays L.) in Gyeonggi-do of South Korea, and analyzed volunteer samples using strip test kits and polymerase chain reaction (PCR) methods. We thereby collected 44 volunteers of released LM maize in 169 locations around ports, from roadsides, feed factories and stockbreeding farmhouses. We found 4 positive samples at 3 sites using strip test kits. Based on the PCR analysis, the LM maize plants were found using event-specific primers. These results suggested that our monitoring is necessary to detect the presence of released LM maize in the natural environment of South Korea.

자연생태계 모니터링을 통한 glyphosate와 glufosinate-ammonium에 저항성을 가지는 유전자변형 캐놀라의 발견

신수영,조범호,문정찬,이중로,최원균,설민아,김미정,송해룡,Shin, Su Young,Jo, Beom-Ho,Moon, Jeong Chan,Lee, Jung Ro,Choi, Wonkyun,Seol, Min-A,Kim, Mi-Jeong,Song, Hae-Ryong 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.4

식품용 및 사료용 유전자변형작물은 매년 국내에 수입이 되고 있으며 유전자변형 캐놀라는 중요한 수입 작물 중의 하나이다. 유전자변형작물의 국내 재배는 허용되고 있지않지만 수입양은 매년 증가하고 있는 실정이다. 본 연구에서는 2009년부터 2013년까지 전국 9개 도를 대상으로 국내 수입된 유전자변형 캐놀라의 자연생태계 내 유출 정도를 파악하고자 모니터링을 실시하였다. 모니터링 조사는 항만, 사료공장, 축산농가, 운송로, 축제지 주변을 대상으로 실시하였다. 채집된 유전자변형 캐놀라 의심시료는 DNA에 기반을 둔 방법과 단백질에 기반을 둔 방법으로 분석하였다. 총 1850개 지점 조사에서 총 595개의 의심시료를 발견하였으며 6개의 유전자변형 캐놀라를 확인하였다. 국내 수입 승인된 단일이벤트 T45, MS8, RT73, Rf3, Topas 19-2의 primer를 사용한 PCR반응을 통해 2개의 glyphosate 저항성을 가지는 이벤트와 4 개의 glufosinate-ammonium에 저항성을 가지는 이벤트를 확인하였다. 본 연구를 통해 자연환경 모니터링 연구가 자연생태계 내의 유전자변형작물의 비의도적 유출을 예방하기 위해 매우 유용하다는 것을 알 수 있으며 사후관리를 수행하기 위한 기초자료를 구축하는데 활용될 것으로 사료된다. Living modified (LM) crops are imported each year to South Korea as food and feeds, LM canola being one of the imported crops. The cultivation of LM crops is not permitted in South Korea but the import of these crops is increasing. In this study, we surveyed the environmental risk of imported LM canola at 9 provinces, from March 2009 to June 2013. Monitoring of canola was conducted around feed factories, roadsides, harbors, farmhouses, and flower festival regions. From the total of 595 canola samples collected from 1850 monitoring sites, we identified 6 LM canola samples. The LM canola samples were subjected to protein and DNA based analysis. PCR analyses using approved 5 single event primers (T45, MS8, RT73, Rf3 and Topas 19-2) revealed that two crops were glyphosate-resistant LM canolas, and four were glufosinate-resistant LM canolas. This study suggested that environmental monitoring is a useful research tool to manage LM crops unintentionally introduced into the environment in South Korea. This result can be used as a basis for future post-management of canola crops.

국내 승인 LM면화의 자연환경 모니터링을 위한 multiplex PCR 개발

조범호,설민아,신수영,김일룡,최원균,엄순재,송해룡,이중로,Jo, Beom-Ho,Seol, Min-A,Shin, Su Young,Kim, Il Ryong,Choi, Wonkyun,Eum, Soon-Jae,Song, Hae-Ryong,Lee, Jung Ro 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.1

면화(cotton)는 섬유를 수확하고, 면실유는 식용으로 가공 후 남은 것은 다시 사료로 이용되어 다방면으로 다양하게 활용되는 작물이다. LM 면화는 옥수수, 대두, 캐놀라와 달리 아시아권(중국, 인도 등)에서 가장 많이 재배되고 있으며, 우리나라는 2013년까지 세계 1위의 LM 면실(사료용) 수입국이며, 세계 4위의 면실박 수입국으로 해마다 증가하는 LM 면화의 수입량과 맞물려 유통 및 소비과정에서의 비의도적으로 유출 가능성이 증가함에 따라 LM 면화의 자연생태계 위해성 평가 및 안전관리가 요구된다. 본 연구에서는 국내 수입 승인 LM 면화 6개 이벤트(MON15985, MON531, GHB614, LLCOTTON25, MON88913, MON1445)의 동시증폭 검출법(multiplex PCR)을 개발하여 보다 신속하고 명확한 검출기법을 확립하고자 하였다. 최적 multiplex PCR 반응 조건은 2개 LM 면화 이벤트 MON15985 (214 bp), MON531 (270 bp)와 4개 LM 면화 이벤트 GHB614 (119 bp), LLCOTTON25 (164 bp), MON88913 (276 bp), MON1445 (389 bp)가 한번의 반응에 명확하게 검출되는 최적 반응 조건 및 primer 반응 농도의 조절을 통해 서로 다른 생성물 크기로 명확히 구분되도록 하였고, 최적 primer 농도는 반응액 최종농도 0.2~0.66 pmol로 primer 쌍 마다 각각 다른 최적 농도 조합의 cocktail을 만들어 활용하였다. Duplex PCR 반응 조건은 초기 $95^{\circ}C$ 5분 반응 후, $95^{\circ}C$ 15초, $55^{\circ}C$ 20초 15회 반응하고, 다시 $95^{\circ}C$ 15초, $60^{\circ}C$ 20초 25회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌고, tetraplex PCR 반응 조건은 $95^{\circ}C$ 5분 반응 후, $95^{\circ}C$ 15초, $60^{\circ}C$ 20초 50회 반응하였을 때 최적 검출이 이루어졌다. 본 연구에서 개발된 multiplex PCR 검출법은 국내 수입 유통 LM 면화의 자연환경 모니터링에 활용함에 있어 요구되는 연구인력, 시간 및 비용을 보다 효율적으로 개선하는데 적용될 수 있을 것으로 사료된다. The growth area of living modified (LM) cotton has steadily increased every year, since its first commercialization in 1996. Development of environmental risk assessment tools and techniques for LM cotton is required for ecosystem safety. We therefore developed multiplex PCR assays for simultaneous detection of two (MON15985, MON531) and four (GHB614, LLCOTTON25, MON88913 and MON1445) LM cotton events approved in Korea, with event specific primer pairs. The PCR reactions were optimized by using event specific primers of six LM cottons at various concentrations. The reactions allows amplification of estimated amplicons of MON15985 (214 bp), MON531 (270 bp), GHB614 (119 bp), LLCOTTON25 (164 bp), MON88913 (276 bp), and MON1445 (389 bp) from multiplex PCR reactions. The multiplex PCR assay developed allowed that two annealing steps (15 cycles at $55^{\circ}C$ and 25 cycles at $60^{\circ}C$) were performed for amplification of distinguished two LM cottons, and only one annealing step (50 cycles at $60^{\circ}C$) was necessary for tetraplex PCR. Primer extension step of all PCR reactions was skipped for time-effective amplification. Our methods suggest that two multiplex PCR assays can be cost-effective and a rapid diagnostic tool for environmental LMO monitoring of six LM cottons.

dsRNA의 정제 및 큰물벼룩에 대한 생태독성평가

김동욱 ( Dong Wook Kim ),최원균 ( Wonkyun Choi ) 한국환경농학회 2018 한국환경농학회 학술대회집 Vol.2018 No.-

최근 작물의 유전자 또는 해충의 유전자 발현을 억제하여 상품성과 생산성을 향상시킬 목적으로 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 기술이 적용된 LM 작물이 개발되어 이용되고 있으며, 이러한 신기술이 적용된 LMO는 LM 작물 분야에서 신품종 개발에 새로운 기회를 제공하는 것으로 평가되고 있다. 국내에서도 LM 작물의 개발단계에서의 큰물벼룩에 대한 LM 작물의 급성독성평가가 수행된바 있으나 주로 개발된 GM 벼의 추출물을 이용하여 위해성평가가 대부분이었다. GM 작물에 도입된 RNAi 중 해충저항성을 보이는 DvSnf7 유전자를 활용하여 RNAi 유전자의 비표적생물체에 대한 위해성평가와 더불어 수생생물인 큰물벼룩에 대한 위해성평가기법 개발을 위해 본 연구를 수행하였다. 본 연구실에서 확립한 대장균을 이용한 dsRNA 발현 시스템을 활용하여 대량의 dsRNA를 발현시킨 후 RNaseA와 DNaseI을 처리하여 순수한 dsRNA를 정제하였다. 또한 사육환경 내에서 dsRNA의 안전성을 확인하고자 시간별로 dsRNA를 상온에서 최대 5일까지 안전성이 확인되었다. 큰물벼룩에 대한 위해성평가는 농촌진흥청과 EPA 가이드라인에 따라 급성독성평가로 진행하였으며 30마리씩 2주간 사육한 건강한 부모세대에서 태어난 24시간 이내의 어린개체를 사용하였다. 100ml의 사육수에 DvSnf7 dsRNA와 GFP dsRNA를 각각 1 mg/L 농도가 되도록 처리하였으며 각실험은 10마리씩 3반복으로 수행되었다. dsRNA를 처리한 지 1시간, 2시간, 24시간, 28시간 후 유영저해 개체수와 사망개체수를 측정하였다. 그 결과 DvSNf7 dsRNA는 GFP dsRNA와 비교하여 큰 물벼룩에 급성독성을 보이지 않는 것을 확인하였다. 본 연구결과 최근 국내 수입승인된 RNAi LM옥수수에 도입된 DvSnf7 유전자를 기내에서 대량으로 배양 후 순수하게 정제하는 조건을 확립하였으며, dsRNA가 수생환경위해성 평가 대상종인 큰물벼룩에 급성독성평가법을 제시함으로써 향후 개발될 RNAi LMO의 위해성평가의 방법을 제시할 수 있었다.

국내 LMO 자연환경 모니터링을 위한 11개 LM 옥수수의 동시검출기법 개발

신수영,임혜송,설민아,정영준,김일룡,송해룡,이중로,최원균,Shin, Su Young,Lim, Hae-Song,Seol, Min-A,Jung, Young Jun,Kim, Il Ryong,Song, Hae Ryoung,Lee, Jung Ro,Choi, Wonkyun 한국식물생명공학회 2016 식물생명공학회지 Vol.43 No.4

유전자변형 옥수수의 개발과 상업적 이용이 증가하면서 유전자변형 옥수수 의심시료의 LMO 이벤트를 확인 할 수 있는 적합한 방법 개발이 필요하다. 국내에서는 상업적 재배와 자연생태계의 의도적 비의도적 LMO의 유출이 허용되고 있지 않다. 본 연구에서는 국내 승인된 11개의 LM 옥수수 이벤트를 동시에 검출할 수 있는 동시검출기법을 개발하였다. 이 방법은 시간과 비용, 노동력을 절감할 수 있는 효율적인 방법으로 4종의 PCR set로 개발하였다. 2012년부터 2014년까지 국립환경과학원 및 국립생태원에서 실시한 LMO 자연환경 모니터링 의심시료를 이용하여 동시검출기법의 효율성을 검증하였다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구의 결과는 LMO 모니터링 시료의 분석에 적합한 방법임을 알 수 있었다. With the increasing development and commercial use of genetically modified maize, it is essential to develop an appropriate method for detection of individual LMO (Living modified organism) events for monitoring the samples. In South Korea, commercial planting and accidental or unintentional releases of LMOs into the environment were not approved. In this study, to increase the efficiency of LMO detection, we developed simultaneous detection methods for 11 LM maize events. This multiplex PCR detection method is economical, as it saves time, cost and labor. We developed 11 individual LM maize events, and applied 4 multiplex PCR sets to the LM maize samples. These results are confirmed by applying the multiplex analysis of LMO environmental monitoring from 2012 to 2014, which represents the unintentionally released LM maize samples. The data were correlated with event specific PCR results. Our results indicate that the multiplex PCR method developed is suitable for detection of LM maize in LMO monitoring.

dsRNA의 꿀벌 급성섭식독성평가

임혜송(Hye Song Lim),정영준(Young Jun Jung),김일룡(Il Ryong Kim),이중로(Jung Ro Lee),최원균(Wonkyun Choi) 환경독성보건학회 2017 한국독성학회 심포지움 및 학술발표회 Vol.2017 No.10