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잔디종자의 물리적 전처리가 캘러스 형성과 식물체 재분화에 미치는 효과
안나영,김용구,라하만 아티쿨,배은지,최수민,이광수,이병현,Ahn, Na-Young,Kim, Yong-Goo,Rahman, Md. Atikur,Bae, Eun Ji,Choi, Su Min,Lee, Kwang Soo,Lee, Byung-Hyun 한국초지조사료학회 2015 한국초지조사료학회지 Vol.35 No.4
잔디에 있어서 낮은 형질전환 효율의 직접적인 원인 중에 하나인 낮은 캘러스 유도율과 식물체 재분화율을 개선시키기 위하여 잔디 완숙종자의 전처리의 효과를 비교해 보았다. 살균한 잔디종자에 swelling 처리를 10분간 실시한 후, sea sand를 이용 하여 sea sand와 종자의 비율을 1:1로 한 다음, shaking 처리는 vortex speed 6 (1,000 rpm)에서 처리시간은 10분간 전처리를 실시하였을 때 무처리구에 비해 2배 이상의 배양 효율을 나타내었다. 또한 sea sand로 전처리한 잔디종자로부터 형성된 캘러스를 식물체 재분화 유도배지에 치상했을 그 효율이 훨씬 더 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 연중 아무 때나 이용할 수 있는 장점을 지닌 잔디 완숙종자로부터 유도시킨 캘러스 세포를 이용하여 Agrobacterium으로 형질전환하는데 있어서 그 효율을 향상 시키는데 큰 기여를 할 것으로 추측된다. In order to improve the transformation efficiency of zoysiagrass by increasing the frequency of callus formation from mature seeds and plant regeneration, the effect of pre-treatment with sea sand was examined. Mature zoysiagrass seeds were given 10 min of swelling time before sea sand treatment using a sea sand and seed ratio of 1 : 1 and a vortex shaking speed of 6 (1,000 rpm) for 10 min. The seeds showed increased callus formation that was more than 2 times the rate in the control. In addition, plant regeneration efficiency was also increased when embryogenic callus induced from sea sand-treated mature seeds was cultured in regeneration medium. These results will be very helpful for improving the genetic transformation frequency of zoysiagrass, a recalcitrant monocot grass.
포장생육 잔디 포복경을 이용한 잔디 형질전환에 있어서 살균방법의 영향
안나영,알람 이프테칼,김용구,배은지,이광수,이병현,Ahn, Na-Young,Alam, Iftekhar,Kim, Yong-Goo,Bae, Eun-Ji,Lee, Kwang-Soo,Lee, Byung-Hyun 한국초지조사료학회 2013 한국초지조사료학회지 Vol.33 No.2
포장에서 생육된 잔디 포복경을 이용한 Agrobacterium 형질전환에 있어서 큰 제한인자였던 곰팡이 오염을 제거할 목적으로 포복경 조직에 대한 새로운 살균법을 개발하고자 하였다. 여러 가지 살균방법 중에서 30% NaOCl로 15분간 처리한 다음 0.1% $HgCl_2$로 25분간 처리 했을 때 포복경 절편체의 생존율이 높았으며, 0.1% $HgCl_2$로 처리시 800 mbar의 진공처리를 5분간 실시했을 때 가장 효과적이었다. 또한 Agrobacterium과 공동배양 시 2.5 mg/l의 amphotericin B를 첨가해 준 배지에서 배양했을 때 가장 높은 생존율을 나타내었다. AmB의 처리는 Agrobacterium의 생장에 영향을 미치지 않았다. 또한 살균된 포복경으로 부터 신초의 재분화에도 영향을 미치지 않았으며 곰팡이 오염만을 효율적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 포장에서 대량으로 생육시킨 잔디 포복경을 이용한 Agrobacterium 형질전환 시 그 효율을 증가시키는데 큰 기여를 할 것으로 추측된다. Zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) is an important forage and turfgrass that spreads by stolons and rhizomes. Zoysiagrass stolon can be used directly for Agrobacterium-mediated genetic transformation by exploiting the potential of direct shoot formation. However, surface sterilization of field-grown stolons is difficult and remains to be explored. We developed an effective surface sterilization and culture method using the stolon explant for infection with Agrobacterium tumefaciens. Among various treatments, sequential disinfection in 30% bleach for 15 min followed by 0.1% mercuric chloride for 25 min resulted in the highest number of clean stolons. The efficacy of mercuric chloride was increased under vacuum conditions by incubating at 800 mbar for 5 min. The inclusion of 2.5 mg/l amphotericin B further prevents fungal growth in in vitro cultures. This protocol would speed up the development of transgenic plants by utilizing field-grown stolon nodes.