Spatial and Temporal Expression Patterns of Apoptosis-related Genes in Rat Spinal Cord During Normal Aging

김종민(Jong-Min Kim),정윤희(Yoon Hee Chung),신정민(Chung Min Shin),박경한(Kyeong Han Park),조사선(Sa Sun Cho),백상호(Sang Ho Baik),차중익(Choong Ik Cha) 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4

The pattern of distribution in rat spinal cord and changing pattern during normal aging of c-Fos, Bcl-2, Bax, and p53 expression were investigated by immunohistochemical staining. Male Sprague-Dawley rats at the age of one week, five months, and two years were studied. C-Fos immunoreactivity was observed diffusely in gray matters in neonatal rats, preferentially located in deep dorsal horn and around central canal. Compared with those of neonatal rats, immunoreactive cells decreased prominently in adult rats. In aged rats, these cells were not seen in any segments. In a transverse section, spatial expression of Bcl-2 and Bax proteins showed a diffuse distribution pattern with immunoreactivity more prominent in the anterior horn. Continuing expression of these proteins was shown in each age group. In adult rats, Bcl-2 immunoreactivity was decreased drastically compared to that of neonatal rats. The immunoreactivity was higher in aged than in adult rats, but the number of immunoreactive cells was not different between aged and neonatal rats. The number of Bax-immunoreactive cells was greater in adult than in neonatal rats; in aged rats, it was similar with that of adult rats. The spinal cords of neonatal rats were not p53-immunoreactive, though p53-positive cells were detected in all segments of adult spinal cord. P53-positive cells were stained along the cellular margin, with a pale central portion. The pattern of p53 immunoreactivity in adult and aged rats was similar; the number of p53- positive cells, however, was higher in aged rats than in adult. In conclusion, we demonstrated that the expression patterns of c-Fos, Bcl-2, Bax, and p53 proteins in rat spinal cord change during normal aging for the first time. 세포사의 한 형태로서 다양한 생리적 혹은 병적 상황에서 일어나는 아포프토시스의 기전을 이해하기 위해 최근 많은 연 구가 이루어져 왔다. 최근에는 신경계통에서 손상에 대해 보이는 반응과 그리고 다양한 퇴행성 질환 (예: 근위축성 측삭 경화증)에서 주된 세포사의 경로로서 생각되고 있다. 이러한 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 c-fos, Bcl-2, Bax, p53 유전자가 척수에서 단백질로 발현되는 양상과 노화에 따르는 그 변화 양상을 규명하기 위해 본 연구를 수행하였다. c-Fos 면역염색성 세포는 생후 1주된 쥐에서는 척수의 회색질에 미만성의 분포 양상을 보였다. 이 세포들은 핵에 국한되 어 둥글게 염색되었다. 5개월된 쥐에서는 c-Fos 면역염색성 세포가 많이 감소하였으며 24개월된 쥐에서는 발견되지 않았다. Bcl-2 면역염색성 세포는 척수 회색질에서 미만성의 분포를 보였으나 라미나 VIII과 IX에서 더 뚜렷한 양상이었다. 세포 는 중앙 부위는 염색이 되지 않고 변연부를 따라서 염색되는 특징이 있었다. 5개월된 쥐에서는 Bcl-2 면역염색성 세포가 감소하였으며 24개월된 쥐에서는 Bcl-2 면역염색성 세포는 다시 증가하는 양상을 보였다. Bax 면역염색성 세포의 분포 양상은 Bcl-2 면역염색성 세포와 유사하였다. 그러나 Bax 면역염색성 세포의 수가 훨씬 많았다. 세포질이 풍부하고 큰 다각형의 세포 혹은 크기는 더 작고 별모양인 세포들이 1주된 쥐의 횡단 조직에서 미만성의 분포를 보였다. 5개월된 쥐에서는 Bax 면역염색성 세포의 수가 더 증가하였고 24개월된 쥐에서는 5개월과 유사하였다. p53 면역염색성 세포는 1주된 쥐에서는 발견되지 않았고 5개월된 쥐와 24개월된 쥐에서 노화에 따라 증가하는 양상을 보 였다. Bcl-2 면역염색성 세포와 유사하게 중앙 부위는 염색이 되지않고 변연부를 따라서 염색되는 특징이 있었다. 이 결과로 흰쥐 척수에서 c-fos, Bcl-2, Bax, p53 유전자의 발현이 연령 증가에 따른 일정 형태를 보인다는 것을 알 수 있다. 이 유전자의 산물들이 노화에 따라 변화하는 양상을 보인다는 사실은 아포프토시스가 신경계통의 발생과 노화 과정에서 작용하고 있다는 한 증거가 된다. 이러한 형태학적 자료는 세포사 기전에서 노화와 연관된 변화를 연구하거나, 혹은 근위축성 측삭 경화증과 같은 신경퇴행성질환의 연구에서 기초 지식으로서 활용될 수 있을 것이다.

노화된 흰쥐 대뇌겉질에서 NOS 신경세포의 분포에 관한 면역세포화학적 연구

정윤희(Yoon Hee Chung),신정민(Chung Min Shin),이왕재(Wang Jae Lee),황덕호(Douk Ho Hwang),이병란(Byung Lan Lee),조사선(Sa Sun Cho),백상호(Sang Ho Baik),차중익(Choong Ik Cha) 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4

Nitric oxide (NO)는 생체 내에서 수많은 생리과정에 관여하며 특히 중추신경계통에서는 신경전달물질로서 synaptic plasticity와 밀접한 관련이 있다고 알려졌다. 노화 흰쥐에서는 NO의 생성이 감소했음을 시사하는 연구들이 있지만 NO를 생성하는 세포의 노화에 따르는 형태학적 연구는 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 노화군 흰쥐와 대조군 흰쥐의 대뇌겉질 및 해마의 각 영역에서 nitric oxide synthase (NOS) 신경세포의 분포와 형태 양상을 면역세포화학 방법과 in situ hybridization 방법을 이용하여 조사하였는데 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 대조군 흰쥐와 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포들은 대뇌겉질 및 해마의 전 영역에 고르게 분포되어 있었다. 2. 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포의 가지돌기는 가지치기 양상이 많이 감소했으며 길이도 짧아졌다. 3. 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포의 수가 유의하게 감소되어 있었는데 부위별로 달랐다. 그 중 50% 이상 감소된 부위는 띠겉질 (cingulate cortex), 마루엽겉질 1영역 (parietal cortex area 1), 관자엽겉질 2, 3영역 (temporal cortex area 2, 3), 뒤통수엽겉질 2영역의 내측 부분 (medial part of occipital cortex area 2), 뒤통수엽겉질 1영역의 monocular와 binocular 부분 (monocular and binocular of occipital cortex area 1), 속후각겉질 (entorhinal cortex), 해마 (hippocampus proper), 치아이랑 (dentate gyrus), subiculum 등이다. 4. 노화군 흰쥐에서 NOS 신경세포는 대조군보다 염색성이 감소되었다. 5. In situ hybridization 방법에 의하면 노화군 흰쥐에서 NOS mRNA 양성세포의 수가 대조군 흰쥐보다 감소하였다. 이상의 소견으로 미루어 볼 때 노화에 따라 NOS 신경세포 수는 감소한다는 형태학적 증거를 파악하였고 이에 따라 NO 의 생성도 감소함으로써 학습과 기억 능력의 감퇴가 수반되는 노화의 한 현상을 설명할 수 있는 일부 원인이 될 수 있으리라고 추정된다. Nitric oxide (NO) involvement has been demonstrated in mechanisms of synaptic plasticity, particularly in hippocampal long-term potentiation, a mechanism that underlies certain forms of learning and memory. Further, NO has been shown to regulate various neurotransmitters which play an important role in learning and memory. Several findings suggest that NO production may be decreased in the aged rat. Changes in the nNOS-containing neurons with aging were demonstrated by immunocytochemistry and in situ hybridization. NOS-immunoreactive cells in aged rats were present in all cortical areas and the hippocampus, and the pattern of distribution was similar to that of the control group. The number of NOS-immunoreactive cells in the cerebral cortex was significantly decreased in the aged rats, but the extent of changes was variable in each area, and ranged from mild decrease (<30%) to severe decrease (>50%). Severely decreased areas were the cingulate cortex, parietal cortex area 1, temporal cortex area 1, 2, 3, medial part of occipital cortex area 2, monocular and binocular part of occipital cortex area 1, entorhinal cortex, hippocampus proper, dentate gyrus and subiculum. Moderately decreased areas (30~50%) were frontal cortex area 1, 2, 3, parietal cortex area 2, forelimb, hindlimb, lateral part of occipital cortex area 2. Slightly decreased area was insular cortex. Morphologically, the number of dendritic branches seemed to be decreased in aged group and the length of dendrites of NOS-IR neurons showed a tendency to shorten. These results indicate the involvement of neuronal system containing NOS in the aging brain, and provide the first morphological evidence for the loss of NOS neurons in the cerebral cortex of the aged rats by immunocytochemistry. Further multidisciplinary investigations involving normal aging and neurodegenerative disease such as Alzheimer’s disease are needed to clarify the importance of nitric oxide changes in the cerebral cortex with aging.

hESC로부터 유래된 혈관내피전구세포를 위한 최적의 배양조건 확립

김주미 ( Ju Mi Kim ),문성환 ( Sung Hwan Moon ),이민지 ( Min Ji Lee ),오인록 ( In Rok Oh ),신정민 ( Jeong Min Shin ),박순정 ( Soon Jung Park ),정선화 ( Sun Hwa Chung ),김문규 ( Mun Kyou Kim ),이경일 ( Kyung Il Lee ),정형민 ( Hyung 한국조직공학과 재생의학회 2008 조직공학과 재생의학 Vol.5 No.3

Human embryonic stem cell(hESC) can be very valuable source for the cell therapy due to their pluripotency when they differentiated into specialized cell types. Conventionally, differentiated cell population were obtained from spontaneously formed embryoid body(EB) which could contain various cell types. In this study, we described the optimization of culture condition for endothelial precursor cells derived from human embryonic stem cells(hESC-EPCs). First, we compared the expression of endothelial precursor cell markers such as CD133, CD34 and KDR in day 7 hEBs and isolated CD133 and KDR double positive population as hESC-EPCs. Second, we compared the culture medium and ECM coating to optimize culture condition for hESC-EPCs. As the result, we could confirm EGM-2 and collagen coating were optimized condition to culture of hESC-EPCs. After conducting optimized culture condition for hESC-EPCs, we examined the maintenance of characteristics of hESC-EPCs cultured in optimized culture condition as vascular cells. Finally, we could confirm the characteristics of hESC-EPCs cultured in optimized condition as vascular cells were maintained in developed optimized culture condition. Furthermore, the optimized culture condition developed in this study will be useful to culture of other vascular lineage cells derived from hESCs.

인간배아줄기세포 유래 배상체내의 신경세포군 확인과 분화과정 동안 이뤄지는 신경발생과정의 이해

김동환 ( Dong Hwan Kim ),문성환 ( Sung Hwan Moon ),김주미 ( Ju Mi Kim ),이민지 ( Min Ji Lee ),신정민 ( Jeong Min Shin ),이경일 ( Kyung Il Lee ),박순정 ( Soon Jung Park ),정선화 ( Sun Hwa Chung ),김희정 ( Hee Jung Kim ),정형민 ( Hy 한국조직공학·재생의학회 2009 조직공학과 재생의학 Vol.6 No.4

Recently, human embryonic stem cells(hESCs) have been highlighted to understand early embryogenesis as well as to apply to clinical cell therapy. During human embryogenesis, dynamic processes of early neuronal development are very important to elucidate their developing mechanism. However, the mechanism has not been entirely clear. The formation of embryoid bodies(EBs) derived from hESCs is a tissue-like spheroids in suspension culture and has a potential to differentiate into the three germ layers. Even though many kinds of specific cell makers have been studied, the specific proteins expressed from differentiated cells have been elusive. The objective of this study is to investigate the expression of neuronal protein while EBs is differentiating from hESCs(day 5, 10, 15 and 20). The expressions of neuronal specific makers such as Neurofilament 68kDa(NF 68), tubulin III(TuJ-1) and microtubule-associated protein 2(MAP2) in each EBs stage were analyzed by immunofluorescence(IF). The expressions and localization of neuronal specific markers were shown to be different depending on EBs stages. NF 68 positive cells were expressed on the surface of EBs at day 10 and the expression of NF68 almost disappeared at day 20. MAP2 was not detected in EBs at day 10, whereas it began to be slightly detected on the surface of EBs at day 15. On the other hand, TuJ-1 positive cells were found at all stages and their expression levels were maintained until day 20. These results demonstrate neuronal specific markers can be expressed differently depending on EBs stages, suggesting this allows us to probably understand the early development of neurogenesis in hESCs. Furthermore, this idea expands that we are able to understand the development of all specific cells differentiated from early human embryogenesis.

척수신경세포에서의 아포프토시스 관련인자에 관한 면역조직화학 연구

김종민,정윤희,신정민,박경한,조사선,백상호,차중익 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4

흰쥐 대뇌겉질과 해마에서 노화에 따른 미세순환조절인자의 변화에 관한 연구

정윤희,신정민,김명주,박경찬,차중익 대한해부학회 2000 Anatomy & Cell Biology Vol.33 No.4

노화된 흰쥐 대뇌겉질에서 NOS신경세포의 분포에 관한 면역세포화학적 연구

정윤희,신정민,이왕재,황덕호,이병란,조사선,백상호,차중익 대한해부학회 1999 Anatomy & Cell Biology Vol.32 No.4