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- 저자 : 박영인(Yong In Park) (검색결과 5 건)
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E. coli K-12 균주로부터 글루타치온 합성 유전자의 클로닝
남용석,박영인,이세영 한국산업미생물학회 1991 한국미생물·생명공학회지 Vol.19 No.6
글루타치온 생산증대를 도모하기 위하여 글루타치온 합성에 관여하는 효소들인 GSH-I 및 GSH-II 유전자들을 pBR322 벡터에 클로닝하였다. gshI 유전자를 클로닝하기 위하여 GSH-I 효소활성이 결여된 GS903 균주를 분리하였다. E. coli K-12 염색체 DNA로부터 분리된 3.6Kb PstI DNA 절편내에 gshI 유전자가 존재하였으며 이 절편을 pBR322 벡터에 클로닝하였다. gshII 유전자는 2.2Kb PstI-BamHI DNA 절편내에 존재하며 이 절편을 pUC13 벡터에 클로닝하였다. 플라스미드의 copy number와 gsh 유전자들을 포함하고 있는 삽입 DNA의 크기의 차이에 의한 gsh 유전자들의 발현 정도를 조사하기 위하여 pGH100, pGH101, pGH200, pGH201, pLF4, pLF6 그리고 pGH300같은 여러 플라스미드를 제조하였다. pBR322 플라스미드 대신 pUC계통의 플라스미드를 사용함으로써 gshI 유전자의 발현이 의해 2배 이상 증가하였다. 그러나 벡터 플라스미드내에 존재하는 gsh 유전자들을 포함하는 삽입 DNA의 크기의 차이에 의해서는 gsh 유전자들의 발현이 영향을 받지 않았다. To increase the production of glutathione by the expression of recombinant gsh plasmids, two genes responsible for the biosynthesis of glutathione were isolated and cloned. To clone a gshI gene, the GS903 mutant strain, which is deficient in γ-glutamylcysteine synthetase activity, has been raised. A gshI gene was cloned using pBR322 plasmid as a 3.6Kb PstI DNA fragment isolated from E. coli K-12 chromosomal DNA. Also a gshII gene was cloned using pUC13 plasmid as a 2.2Kb PstI-BamHI DNA fragment. To study the effects of plasmid copy number and passenger DNA size on the expression levels of the gsh genes, various recombinant plasmids containing different sets of genes were constructed. The expression levels of the gsh genes were increased approximately twice higher in pUC series plasmids than that in pBR322 plasmid. But the sizes of the passenger DNA containing the gsh genes in the vector plasmid did not affect on the expression levels of the gsh genes.
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Bacillus stearothermophilus β-D-Xylosidase 유전자의 크로닝 및 Escherichia coli에서의 발현
오세욱,박성수,박영인,최용진 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.2
토양 분리균인 B. stearothermophilus chromosome의 유전자 은행으로부터 E. coli HB101 균주에 β-D-xylosidase 생산능력을 갖게하는 5.4 kb와 6.4 kb의 두 DNA 절편을 분리, pBR322에 크로닝하여 각각 pMG01과 pMG02의 재조합 플라스미드를 얻었다. 상기 두 B. stearothermophilus DNA 절편의 restriction map을 작성하고 이것을 기초로 하여 β-D-xylosidase 유전인자의 위치를 확인함과 동시에 pUC18에 subcloning하여 각각 2.2kb와 1.Okb의 DNA 단편이 삽입된 β-D-xylosidase 양성의 pMGl와 pMG2를 분리하였다. 상기 두 β-D-xylosidase 유전인자는 Southern blotting에 의해서 B. stearothermophils에서 유래된 서로 다른 별개의 유전인자임을 확인할 수 있었다. 또한 두 β-D-xylosidase는 다같이 xylobiose, xylotriose, xylotetrose 및 xylopentose를 효율적으로 분해, 주 분해산물로서 다량의 xylose를 생산하였으며, 특히 pMGl 플라스미드상의 β-D-xylosidase 유전인자는 β-D-xylosidase 활성 뿐만 아니라 α-L-arabinofuranosidase 활성도 함께 가지고 있는 bifunctional protein으로 추측되었다. Bacillus stearothermophilus isolated from soil was identified to express multiple extracellular xylanases. Two HindⅢ restriction fragments of 5.4 and 6.4 kb from B. stearothermophilus genomic DNA were cloned into pBR322 to obtain recombinant plasmids pMG01 and pMG02, respectively, which enabled E. coli HB101 cells to produce β-D-xylosidase activity. By subcloning into pUC18 and Southern blotting, the loci of the β-D-xylosidase genes were elucidated to be on non-homologous DNA fragments of 2.2kb from pMG01(pMGl) and 1.0kb from PMG02(pMG2), respectively. The two enzymes produced in E. coli cleaved xylobiose, xylotriose, xylotetrose and xylotetrose to produce xylose as a major end product. The gene on pMGl, distinct from that on pMG2 was observed to encode a bifunctional protein that displayed both β-D-xylosidase (EC.3.2.1.37) and α-L-arabinofuranosidase activities(EC.3.2.1.55).
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Bacillus stearothermophilus로부터 Endo-xylanase 유전자의 클로닝 및 Escherichia coli에서의 발현
조쌍구,박성수,박영인,최용진 한국산업미생물학회 1992 한국미생물·생명공학회지 Vol.20 No.3
내알카리성 및 내열성 xylanase를 생산하는 토양 분리균인 Bacillus stearothermophilus의 chromosomal DNA와 pBR322 plasmid DNA의 HindⅢ 절단 DNA 단편을 ligation시켜 E. coli HB101을 형질전환, 약 5천개의 형질전환체를 얻었으며 이들 중에서 세개의 xylanase 양성 형질전환체를 분리하였다. 상기 세 xylanase 양성 형질전환체로부터 분리한 제조합 plasmid(pMG11, pMG12 및 PMG13)는 다같이 xylanase활성과 관계되는 B. stearothermophilus 유래의 동일 4kb 외래 DNA을 가지고 있었으나, pMG13은 외래 DNA의 삽입 방향만이 다름을 확인하였다. B. stearothermophilus 균주는 최소한 세개 이상의 xylanase 활성단백질을 생산하는 것으로 관찰되었으며, xylanase 양성 형질전환체는 그 중 분자량이 가장 큰 효소단백질을 생산하는 것으로 판단되었다. 한편, 형질전환체 xylanase는 xylotetraose 이상의 xylo-oligosaccharide와 xylan 기질에 작용하여 최종 산물로서 xylobiose와 xylotriose을 생산하는 endo-acting 효소로서, trans-xylosidase 활성도 가지고 있는 것으로 추측되었다. Genomic DNA of Bacillus stearothermophilus, which expressed alkalophilic and thermophilic xylanases, was partially digested with HindⅢ, cloned into pBR322, and subsequently transferred into the Escherichia coli HB101 cells. Three among 5,000 transformants screened formed clear zones around their colonies. From the functional clones, three recombinant plasmids(pMG11, pMG12 and pMG13) had been isolated, and they were identified to carry the same 4 kb HindⅢ fragment originated from B. stearothermophilus which was responsible for the xylanase activity. pMG13, however, had the foreign DNA of opposite orientation compared to the other two recombinant plasmids. This recombinant plasmid gave much lower xylanase activity. B. stearothermophilus was observed to produce at least three xylanase activities as evidenced by the PAGE-xylan zymogram. The xylanase from E. coli HB101/pMG12 was judged to correspond to the largest among the three B. stearothermophilus xylanases observed in the zymogrom. The enzyme hydrolyzed xylooligosaccharides larger than xylotriose and degraded xylan to produce xylobiose and xylotriose as major products. The xylanase was considered to have trans-xylosidase activity, too.
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