Pyrosequencing assay를 이용한 Clarithromycin 내성 Helicobacter pylori mutation 확인에 관한 연구

이정현 건국대학교 대학원 2010 국내석사

Clarithromycin resistance in Helicobacter pylori is a major cause of eradication therapy failure. The objective of this study was to determine the frequency and type of mutations in the 23S rRNA gene by pyrosequencing assay which are associated with clarithro-mycin resistance. From August 2005 to September 2008, gastric biopsy specimens were collected Konkuk University hospital. H. pylori infection was defined as showing a positive result in at least one of the following 2 tests : a CLO test, and a Giemsa stain. After triple therapy, patient had UBT test and then 94 sample from patient with a positive result on UBT test had been collected. Extracted DNA from this sample was amplified by PCR and analyzed by pyrosequencing assay. There were 42 mutations from 94 samples. They were all positive for A2143G mutation. The rate of identification of 23S rRNA point mutation in experimental group was 44.7% compared to the rate of control group(5.3%), Pyrosequencing assay had advantage over conventional sequencing in the aspect of cost and time in detection of point mutation of H.pylori 23S rRNA. Therefore there was clinical usefulness of detection of clarithromycin resistance mutation in H. pylori by pyrosequencing. Helicobacter pylori (이하 H. pylori)는 그람 음성균으로 위염, 소화성 궤양 및 점막 연관 림프 조직형 위 림프종의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. H. pylori를 제균치료로 박멸하게 되면 만성 위염이 정상화되고 소화성 궤양의 재발률을 낮춘다고 알려져 있으며 제균 치료로는 삼제요법으로 proton pump inhibitor와 amoxicillin그리고 clarithromycin을 병용하여 투여하는 것이 국내에서의 보편적인 1차 치료로 자리잡아오고 있다. 그러나 최근 제균 치료 실패율이 증가하고 있고 clarithromycin에 대한 내성 증가가 주요 원인으로 제기되고 있다. 그러나 H. pylori의 clarithromycin내성에 관한 검사 중 gold standard로 알려진 방법은 배양을 통한 항생제 감수성 검사인데, 이 검사를 임상에서 일상적으로 시행하는 것은 어렵다. 그러나 최근에 다양한 미생물 분야에서 이용되고 있는 pyrosequencing assay방법은 배양을 할 필요가 없으며, gene sequencing을 빠르고 간편하게 수행할 수 있는 검사법으로 이를 이용하여 내성을 야기하는 것으로 알려진 23S rRNA gene의 2142 혹은 2143 위치의 점돌연변이 유무를 알게 된다면 환자의 1차 치료 약제를 선택하는데 도움이 될 것으로 생각된다. 따라서 1차 제균치료에 실패한 환자군에서pyrosequencing을 통하여 Clarithromycin 내성과 연관된 유전자 변이를 확인하고 제균치료 성공군과의 비교를 통하여 두 군간의 차이를 알아보고 pyrosequencing을 내성유무의 확인이 갖는 임상적 유용성을 알아보고자 한 것이 본 연구의 목적이다. H. pylori 감염이 확인되어 1차 제균 치료를 하였으나 치료가 되지 않았던 환자의 조직 94례에서 DNA를 추출하여 PCR 방법을 이용하여 증폭한 후 Pyrosequencing assay를 시행한 결과 42예에서 A2143G 점 돌연변이를 확인하였다. 1차 제균치료에 성공한 군(n=94)에서는 5명의 환자에서만 A2143G 점 돌연변이가 관찰되어 1차 제균치료 실패군에서 돌연변이의 빈도가 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. (p=0.00) 따라서Pyrosequencing assay를 이용한 H. pylori의 clarithromycin에 대한 내성관련 점 돌연변이 검사는 시간적인 측면이나 경제적인 측면에서 임상적 유용성이 있을 것으로 생각된다.

Analysis of Microbial Diversity of Bigeum Island Soil using Culture-Dependent and Culture-Independent Approaches and Description of the Novel Isolated Strains : 배양 의존적 및 비의존적 접근법을 이용한 비금도 토양의 미생물 군집분석과 새로운 분리균의 특성 관한

金判庚 忠南大學校 大學院 2011 국내박사

Microorganisms are an important constituent of the natural ecosystem and take a major role in the circulation of materials. Microorganisms also, provide us with antibiotics, enzymes, and bioactive compounds. Thus, microbiologists have consistently conducted a lot of research to isolate new microorganisms in the nature. Nonetheless, the number of bacterial species that we can cultivate is thought to be less than 1% of the total number due partly to the limited culture techniques. In order to analyze microbial diversity in Bigeum Island, of which soil is known to be enriched with germanium, and to isolate novel bacteria from the soil, both culture-dependent and culture-independent methods were employed in this study. For the culture-dependent method diluted humic acid-vitamin, R2A, and nutrient media were formulated to mimic the natural, oligotrophic environment. As a result, 406 bacterial species belonging to 5 phyla were isolated. Among the 406 isolated strains, which were dominant by Actinobacteria (46.55%) and Proteobacteria (37.68%), 44.08% were candidates for novel species or genus. Specifically, 68 strains were identified as uncultured bacteria, and 16S rRNA analysis indicated that 17 strains of Actinobactria and 24 strains of general Bacteria were candidates for novel species. These results demonstrate that a highly diverse microorganisms could be isolated from a given soil sample utilizing diluted commercial or oligotrophic media. On the other hand, the culture-independent pyrosequencing method revealed that the Bigeum Island’s soil contained a diverse microbial population composed of 51 phyla, 117 classes, 288 orders, 694 families, 1436 genus, and 2448 species, confirming that a majority of microorganisms in soil are not culturable, but can be identified by pyrosequencing analysis. To investigate whether different nutrient compositions and concentrations are important for determining microbial distribution and isolating novel bacteria species from the same soil sample, bacterial DNA was directly extracted from several isolation media and subjected to DGGE analysis. The results showed that samples from each medium displayed distinct band patterns. Sequencing of each DGGE band indicated more distribution of 3 groups, unclassified Bacteria, unclassified Bacillales, and unclassified proteobacteria, in DGGE clone than in the isolates. These results suggest that developing novel culture and analysis methods may be more cost-effective than selecting appropriate medium and culture condition for normally unculturable microorganisms. Among the isolated strains, a novel strain candidate, the BH097, was chosen and subjected to further analyses. The BH097T strain, a strictly aerobic bacterium, is motile rods and produces spherical endospore at a therminal position in swollen sporangia. It grows between pH 5.5 and 9.5 (optimal growth at pH 8.0-8.5), between 20 and 52 °C (optimal growth at 40 °C), and at salinities of 1-22 % (w/v) NaCl optimal growth at 5-10 % (w/v). Based on 16S rRNA gene sequence analysis, strain BH097T is determined to belong to genus Gracilibacillus under phylum Firmicutes; it shows the most phylogenetic similarity to Gracilibacillus saliphilus YIM 91119T (95.8%), G. thailandensis TP2-8T(95.6%), G. boraciitolerans T-16ST (95.5%), G. quinghaiensis YIM-C229T (95.4%), and G. halophilus YIM C55.5T (95.2%). The DNA G+C content of the new isolate is 37.9 mol%. The major cellular fatty acids of strain BH097T are iso-C15:0, anteiso-C15:0 and C16:0, and its polar lipids consist of diphosphatidylglycerol and phosphatidylglycerol. The isoprenoid quinone is MK-7. The peptidoglycan type is A1γ, with meso-diaminopimelic acid as the diagnostic diamino acid. Based on the polyphasic evidence from this study, Gracilibacillus bigeumensis sp. nov. is proposed, with strain BH097T (=KCTC 13130T =DSM 19028T) as its type strain. 다양한 생물자원 가운데 미생물은 자연 생태계에 중요한 구성요소이며 지구화학적 물질순환에 중요한 역할을 수행한다. 그리고 인류에게 같은 미생물인 병원균을 극복할 수 있는 항생물질과 효소 등 수 많은 생리활성 물질을 인류에게 제공하여 왔다. 따라서 미생물학자와 생태학자들은 자연계에 존재하는 많은 미생물을 더 많이 분리•배양하기 위한 연구을 끊임 없이 수행하여 왔다. 그러나 현재의 발전된 배양법으로 인류가 인공적으로 배양할 수 있는 미생물은 극히 제한적 (1%미만)이다. 배양되는 미생물 이외에 다른 대다수의 난배양성 미생물에 대한 생태학적 역할과 기능에 대해서는 아직도 이해가 적다. 따라서 본 연구에서 비금도는 국내의 게르마늄지대로 알려 있고 섬지역이라는 특수한 자연환경의 토양에 대한 배양 비의존적인 방법인 pyrosequencing을 통해 미생물 다양성을 조사하고 배양의존적 방법으로 기존의 분리배지를 희석하는 방법으로 다양한 세균을 분리하여 연구에 활용 하였다. 분리원 배지로는 Humic acid vitamin 배지, R2 agar, Nutrient 배지와 각각의 배지를 1/2, 1/5, 1/10, 1/100, 1/1000로 희석한 배지를 제조하여 분리용 배지로 사용하였다. 실제 자연환경는 우리가 실험실에 사용하는 분리원 배지보다 비교적 영양분이 매우 미량으로 포함되어 있기 때문이다. 이와 같이 oligotrophic한 희석배지를 이용하여 비금도 토양을 처리하여 약 406 균주를 순수 분리하였다. 특히 희석된 Humic acid 배지에서 다양한 미생물이 분리되었다. 분리된 박테리아는 uncultureable까지 포함하여 5개의 문(phylum)이 분리되었으며, 이 가운데 Actinobacteria (46.55%)와 Proteobacteria (37.68%)로 가장 많이 분리되었다. 반면 같은 비금도 토양의 Pyrosequencing 분석에 의하면, Proteobacteria (31.26%), Bacteroidetes (20.13%), Actinobacteria (16.13%)로 분포하는 것으로 나타났다. 특히 배양의존적 방법에서 가장 많이 분리된 Actinobacteria는 상대적으로 적은 3.76%만 있는것으로 분석되었다. 분리된 406 균주 가운데 16S rRNA Sequencing 분석에 의해서 약 44.08%의 균주가 신속이나 신종의 후보군으로 나타났다. 특히 이 가운데는 68 strain이 uncultured으로 잘 배양되지 않는 균주로 분류되었다. 이들 가운데 97% 상동성 이하의 신균주 후보균으로 Actinobacteria는 17 strain과 일반 Bacteria류는 약 24 strain이 분리되었다. 방선균 가운데는 Nocardioides 속에 속하는 MSL008, MSL033, MSL034, MSL043, MSL087, MSL108, MSL141, MSL168 등 8 strain 신균주로 등록되었다. Leifsonia속에 속하는 MSL 029과 MSL100 균주가 분리되었다. 그리고 Phycicoccus 속 MSL183, Misobacterium속 MSL226, Marmoricola MSL227, Frigoribacterium 속 MSL019, Cryobacterium속 MSL112, Rubellimicrobium속 MSL406, 등 각각 1 strain씩 분리되었다. 그리고 일반 세균류에는 Lysobacter속에 MSL045, MSL053, MSL176, MSL160, MSL229 등 5 strain, 그외 Uncultured로 분류된 19균주가 분리되어 chemotaxnomic 분석를 하고있다. 이 연구에서 비금도 시금치토양에서 분리되어 신종균주로 이미 보고된 균주는 16균주로 전체분리균(406 strains) 가운데 3.94%를 차지하고 있다. 이외도 현재 신종후보균주도 22균주에 신종후보균주로 분류하여 각각 균주의 표현형적 특성을 연구하고 있다. 이 연구에서 분리된 406균주 가운데 38균주가 신종균주 혹은 신종후보 균주로 분류되었다. 따라서 기존의 배지와 그 배지의 희석에 의한 방법으로도 단일 토양에서 매우 다양한 미생물를 분리 배양할수 있는 것으로 나타났다. 배양비의존적 방법인 pyrosequencing 분석에서 나타난 51 Phylum, 117 Class, 288 Order, 694 Family, 1436 Genus, 2448 species가 존재하는 것으로 나타났다. 본 연구에서 분리하여 배양된 미생물은 5 Phylum (9.80%), 10 Class (8.54%), 22 Order (7.63%), 44 Family (6.34%), 93 Genus (6.47%), 308 species (12.58%)로 Pyrosequencing에 의해 분석된 미생물군에 비해 현저히 적은 비율의 미생물만을 분리배양이 가능하였다. 이 연구 결과에서 배양 비의존적 방법인 pyrosequencing 분석결과는 국내 게르마늄 토양지대이며 특수한 자연환경인 비금도의 미생물 군집을 나타내는 중요한 자료이다. 본 연구에서 DGGE 분석은 미생물 분리용 배지에서 배양된 미생물들의 genomic DNA를 직접 추출하여 배지내의 미생물 분포를 분석한 결과 배지에서 자라는 미생물군도 각각의 희석배지에 따라 다른 DGGE band pattern을 나타났다. 이것은 각각의 희석배지에서도 서로 다른 종의 미생물이 생장하고 있다는 것을 의미한다. 따라서 자연환경 중에 존재하는 배양할수 없는 미생물군을 배양 가능한 균주로 분리하기 위해서는 다양한 배지의 사용과 배양조건과 선발에 세심한 노력이 요구된다. 그리고 다양한 토양시료를 일관된 방법으로 미생물자원을 분리하는 것 보다는 단일 토양을 다양한 미생물 분리전략을 수립하여 배양되지 않는 미생물을 분리하는 실험 계획이 보다 중요하다. 그리고 비금도 염전 토양에서 따로 분리된 BH 097균주는 계통분류학적 연구와 chemotaxonomic 분류연구를 통하여 새로운 신종균주로 확인되었다. 따라서 새로이 분리된 신균주을 Gacillibacillus bigeumensis sp. Nov. (KCTC13130, DSM192028)으로 명명하고 기탁보존하고 발표하였다.

Comparison of Pyrosequencing and Phospholipid Fatty Acid (PLFA) Analysis for Characterizing Microbial Community Structure in Soil

아일린로즈다뀌아도 경상대학교 대학원 2013 국내석사

Understanding the microbial community structure of agricultural soils is important for better soil management in order to improve soil quality. Phospholipid fatty acid analysis has been popularly used in determining the microbial community structure in different ecosystems. The use of pyrosequencing has recently been suggested as a new method for characterizing microbial community structures. However, there are no currently available data which compare PLFA analysis and pyrosequencing. In this regard, the microbial community structure of paddy soil under long-term fertilizer treatments was investigated after 45 years using pyrosequencing and PLFA analysis. Treatments were control (no fertilization, Con), compost (COM), NPK, NPK+compost (NPKC), PK, NK, and NP. Soil chemical properties were mainly affected by the addition of compost and inorganic P fertilizer. Total nitrogen and organic matter contents were significantly higher in treatments with compost while available P2O5 and exchangeable calcium were significantly higher in treatments with added inorganic P fertilizer. It was found that microbial communities were responsive to the different fertilizer treatments. PLFA results showed that the soils were dominated by gram-negative bacteria, followed by the actinomycetes, then gram-positive bacteria. Pyrosequencing data also revealed the same trend in terms of microbial composition. The microbial community structure obtained using pyrosequencing was almost the same with those of PLFA and soil chemical properties except in the control and NK, as revealed by PCA. Because pyrosequencing performs a deeper analysis than PLFA, this implies that control and NK may not be as similar as PLFA analysis presented in this study. Although PLFA results were slightly different with pyrosequencing, PLFA proved to be a more reliable tool because it was more responsive to the changes in soil chemical properties.

Pyrosequencing을 이용한 한국 염전의 미생물 군집 다양성 분석

김하늘 韓國外國語大學校 大學院 2012 국내석사

천일염전은 태양열과 바람 등 자연을 이용하여 증발지에서 해수를 증발시켜 소금을 생산하는 시설이다. 해수의 농축이 진행되어 염도가 32-35%에 이르면 소금 결정이 형성된다. 이 과정에서 염전에는 독특한 미생물 군집이 형성되어 있고 산업적으로 이용 가치가 있는 다양한 대사산물이나 색소를 생산하는 미생물들이 존재하는 것으로 알려져 있다. Pyrosequencing은 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용하여 저렴하고 빠르게 미생물 군집을 분석할 수 있는 방법이다. 본 논문에서는 pyrosequencing을 이용하여 전라남도 신안군 증도면의 천일염을 생산하는 염전을 대상으로 미생물 군집 다양성을 조사하였다. Bacteria 군집은 34249 read를 분석한 결과 주로 Proteobacteria (44%)와 Bacteriodates (22%) 그리고 Actinobactereia (20%)가 분포하는 것으로 나타났다. Archaea 군집은 28530 read를 분석한 결과 Euryarchaeota의 Halobacterials가 대부분을 차지하였고, Thaumarchaeota와 분류되지 않은 다양한 그룹의 archaea도 분포하고 있는 것으로 나타났다. 결과를 통해서 염전의 미생물 군집은 염도가 증가하더라도 다양성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. Solar saltern for the commercial production of table salt consists of a series of ponds through which seawater flows, becoming progressively more concentrated with respect to total salts. Then, when the NaCl concentration has reached approximately 32%–35% in the pans known as crystallizers, the precipitation of NaCl occurs. Solar saltern has been a specific microbial community and producing bacteria of many other metabolite and pigment for using industrial product. Pyrosequencing technology allows us to characterize microbial communities using bactrial and archeal 16S rRNA sequences orders of magnitude faster and more cheaply than has previously been possible. We examined microbial communities in the solar saltern in Korea using pyrosequence data. A total of 34249 unique tags belonging to bacteria were recovered. The bacterial community from solar saltern water was consisted mainly to Proteobacteria (44%), Bacteriodates (22%) and Actinobactereia (20%). And total of 28530 unique tags belonging to archaea were recovered. Major composition of archaeal community from saltern waters was Halobacterials but Thaumarchaeota and other unkown groups were also appeared. Bacterial and archaeal diversities were maintained whereas salt concentration increased.

Pyrosequencing-based analysis of bacterial community in the rhizosphere of plants inhabiting coastal sand dune, peat bog, and tidal flat in Korea : Pyrosequencing기법을 이용한 한국의 해안사구, 산지습지, 갯벌에 자생하는 식물의 근권토양 내 세균군집 분석

김현 경북대학교 대학원 2016 국내박사

한반도에서 잘 보존된 환경을 갖춘 지역은 많지 않다. 많은 종류의 동식물 종이 서식지의 파괴, 도시화, 그리고 환경변화로 인해 멸종위기에 처해 있다. 그럼에도 불구하고 일부의 원시 환경을 유지한 지역은 보호구역으로 지정되어 있다. 몇몇 식물 종은 특정 환경 조건을 구비하고 있는 제한된 환경에서만 서식한다. 토양은 식물의 생장과 생육에 있어 가장 중요한 환경적 요소이고 토양 내에서 여러 종류의 생물군과 상호작용하여 생장과 생육에 도움을 주고받는다. 미생물은 다방면으로 식물과 상호작용하여 그들에게 유용한 효과를 주거나 해를 입히기도 한다. 농업에서, 식물병원성 혹은 식물에게 유익한 미생물들에 관한 연구가 많이 진행되었다. 식물의 근권에서 미생물들은 다양한 종류의 화합물을 식물과 교환하거나 생장을 위한 호르몬을 분비하기도 한다. 게다가, 기주 식물에 해로운 미생물에 길항작용을 일으키기도 한다. 식물 또한 토양미생물에 뿌리 삼출물을 분비하여 다양한 종류의 생장인자, 탄수화물, 아미노산, 카복실산 등 미생물에 필요한 물질들을 제공한다. 많은 종류의 미생물이 식물과 상호작용을 하고 있으며, 이러한 공생활동은 가혹한 환경에 자생하는 식물에 특히 중요하다. 특히, 세균은 식물 영양 공급에 있어 중요한 역할을 한다. 세균 세포는 토양 건조 중량의 약 20%를 차지하고 있으며, 이는 근권 토양 내에서 세균의 역할이 크다는 것을 나타낸다. 세균은 여러 종류의 영양소들과 유기물과 무기물을 식물이 이용하기 좋은 형태로 변환시켜 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 토양 내에서 세균 군집의 구성은 근권토양의 지화학적 환경을 나타내는 좋은 지표가 된다. 그래서 근권 내 세균 군집 구성을 조사하는 것은 특정 환경의 근권 토양을 이해하는데 중요한 일이다. 생태학적 관점에서 동식물군의 환경내 구성을 조사하는 것만큼 세균군집을 조사하는 것은 매우 중요한 일이지만, 환경 내에서 배양 가능한 세균의 비율은 2% 가량이다. 세균은 종류별로 매우 다양한 생장조건을 지니고 있어서 모두 배양을 하는 것은 불가능한 일이다. 미생물상의 연구는 배양적 방법을 대체하여, 토양이나 공기 물 등의 시료를 DNA barcoding을 통해 연구가 가능하다. 한반도의 해안사구, 산지습지, 그리고 갯벌에는 매우 독특한 식물들이 자생하고 있다. 그들의 생태학적 특징은 일반의 육상식물과는 매우 다르다. 이러한 독특한 환경에 자생하는 미생물상 역시 일반적인 토양과 다를 것이라는 판단 하에, 세 가지 환경에 자생하는 식물들의 근권 토양의 미생물상을 조사하였다. 각 환경을 대표할 수 대표 식물 종을 선정하였고 그 근권 토양을 채집하여 barcoded pyrosequencing 기법으로 미생물 군집을 조사하였고, 미생물 군집을 비슷한 환경끼리 혹은 다른 환경끼리 비교 분석 또한 수행하였다. 이 연구는 이러한 환경에 존재하는 미생물 군집 구성을 이해하는데 기초적인 자료가 될 것이다.

정수처리 과정별 관 재질에 따른 생물막 형성 및 DGGE와 Pyrosequencing을 이용한 세균 다양성 연구

김근수 단국대학교 대학원 2011 국내석사

정수처리장으로 유입되는 원수와 응집수, 침전수, 여과수, 정수의 평균 종속영양세균수는 1.6 × 10^4 CFU/mL ~ 1 CFU/mL였고, 원수부터 정수까지의 평균 잔류염소농도는 0.08 mg/L ~ 0.88 mg/L였다. 스테인리스관과 동관에 형성된 생물막의 종속영양세균수는 원수, 응집수, 침전수에서 2주만에 2.9 × 10^3 CFU/cm2 이상으로 급격히 증가하였다. 반면, 여과수에서는 스테인리스관과 동관 모두 18 CFU/cm2 이하의 종속영양세균수가 검출되었고, 정수에서는 검출되지 않았다. DGGE와 pyrosequencing 방법들을 이용해 원수, 응집수, 침전수에 존재하는 생물막의 세균 군집 분석결과, 스테인리스관과 동관에서 Rhizobiales와 Sphingomonadales가 지속적으로 나타나는 우점종이였다. 스테인리스관의 경우, 12주차 이후 Flavobacteriales가 새로운 우점종으로 나타났다. Pyrosequencing분석 결과, DGGE 분석에서는 검출되지 않았던 Chitinophagaceae, Sphingobaceriaceae, Rhodobaceraceae, Oxalobacterceae 등 다양한 세균들이 검출되었다. 여과수의 경우, 스테인리스관과 동관에 형성된 생물막에서 Propionibacterium sp., Sphingomonas sp., Escherichia sp., Falvobacterium sp. 등과 유사한 16S rRNA 유전자 서열을 가지는 band들이 검출되었지만, 정수에서는 검출되지 않았다. 본 연구 결과, 스테인리스관과 동관에 형성된 생물막에 지속적으로 존재하는 우점종은 비슷하였지만, 생물막 형성 기간에 따른 생물막내 우점종의 군집비율에는 차이 있었다. 또한 스테인리스관에 형성된 생물막의 경우 시간 변화에 따른 새로운 우점종으로의 변화가 나타났으며, 종속영양세균수 및 종다양성이 동관보다 더 높았다. 추가적으로, 생물막이 구조적으로는 성숙하였을지라도 생물막을 구성하고 있는 세균은 끊임없이 변화하기 때문에 생물막 형성 기간은 생물막 연구 시 고려해야 할 중요한 요인중 하나로 생각된다. Heterotrophic bacteria density of raw, coagulated, settled, filtered, and treated water in water treatment plant ranged from 1.6 × 10^4 CFU/mL ~ 1 CFU/mL. Free residual chlorine concentration of raw to treated water ranged from 0.08 mg/L ~ 0.88 mg/L. Heterotrophic bacterial density of biofilm formed from stainless and copper pipes in raw, coagulated, and settled water was highly increased above 2.9 × 10^3 CFU/cm2 within two week. On the other hand, heterotrophic bacterial density of bioflim formed from stainless and copper pipes in filtered water was detected below 18 CFU/cm2, but treated water was not detected. Heterotrophic bacterial density of biofilm formed from stainless was higher than that from copper pipe. Using DGGE and pyrosequencing methods, we found that Rhizobiales and Sphingomonadales were continuously dominant in both stainless and copper pipes in raw, coaulated, and settled water. In case of stainless pipe, Flavobacteriales appeared new dominant species after twelve week. Through the pyrosequencing analysis, we identified various bacteria with dominant species such as Chitinophagaceae, Sphingobaceriaceae, Rhodobaceraceae, Oxalobacterceae, etc which were not detected by DGGE. In case of filtered water, detected bands of biofilm formed from stainless and copper pipes were identified as Propionibacterium sp., Sphingomonas sp., Escherichia sp., Falvobacterium sp., and etc, based on 16S rRNA gene sequence, while any bands in treated water were not detected. In this study, dominant species of biofilm formed from stainless are similar to those from copper pipe but composition ratio of dominant species by period of biofilm formation was different. In case of biofilm formed from stainless pipe, it was appeared that change to new dominant species and Heterotrophic bacterial density and species diversity were higher than those from copper pipe. Although biofilm was matured structurally matured, component bacteria of biofilm were continuously changed. therefore, period of biofilm s formation would be considered as an important factor for studying biofilm.

Biodiversity informatic study based on DNA barcoding and pyrosequencing technology

김성민 서울대학교 대학원 2012 국내박사

DNA barcoding is a molecular diagnostic method that employs a short DNA sequence to rapidly and accurately identify species. Recently, the difficulties for accurate identification of species were also pointed out, and DNA barcode-based biodiversity database system was required. This study explores the important issues of DNA barcoding from three perspectives: large-scale DNA barcode database, molecular identification using DNA barcoding, and environmental barcoding using pyrosequencing. Firstly, a large-scale web-based database system, Korea Barcode of Life (KBOL) was constructed to create a library of new information about species diversity and to make it as a gateway to access a variety of animal records. The KBOL showed a good role model for networking national biodiversity with the international community that is interested in species diversity. Secondly, various tools and analytic methods have been studied to advance the molecular identification using DNA barcoding. As the result, the molecular identification system using a profile hidden Markov model (HMM) and DNA chip arrayed with species-specific oligonucleotide probes were developed. The sophisticated indexes were produced to properly evaluate indistinct barcode gaps between species. The system for management of specimen-based biodiversity data was developed, which is convenient to keep track of the links between DNA barcode sequences and related voucher specimens. Finally, an efficient filter flow was introduced to remove several artifacts and to study the composition and richness of marine invertebrates estimated from accurately barcoded pyrosequencing data. In the current studies, the bioinformatics problems associated with large-scale database systems, search engines, analytical algorithms, and high-throughput data analysis have been examined as the main scheme. In addition, it has been shown that the analyses of DNA barcode data using the mitochondrial cytochrome c oxidase I (COI) gene have a high resolution for species identification of fish, insects (non-biting midges), and marine invertebrates examined in this study. Such interdisciplinary interpretations are a prerequisite for understanding global biodiversity. These will be also helpful on the socio-economic sides such as quarantine services of organisms, forensics, and food fraud. DNA 바코딩은 DNA 특정 부위의 짧은 염기서열을 이용해 빠르고 정확하게 생물종을 동정하고 종간관계를 판별하는 방법이다. 최근 생물종들의 DNA 염기서열정보가 대량생산됨에 따라 보다 효율적인 생물종정보의 관리를 위한 데이터베이스가 요구되고 종동정 방법과 해석에서의 문제점도 지적되고 있다. 이 연구에서는 DNA 바코딩을 토대로 생물다양성 정보학의 여러 이슈들 중 세가지 중요 주제들 (생물 DNA 바코드 데이터베이스, DNA 바코드를 통한 종동정의 방법과 효율성, 그리고 pyrosequencing을 이용한 생물다양성 연구)을 다룬다. 첫번째로, 대량의 생물종에 대한DNA 바코드 정보의 체계적인 관리를 위해 생물DNA 바코드 데이터베이스 시스템 (KBOL)을 개발했다. 그 결과를 통해 생물 DNA 바코드 정보의 표준화는 물론 생물 바코드 연구의 국제적인 교류를 위한 좋은 롤모델을 보여주었다. 두번째로, 어류, 곤충 (깔따구류), 해양무척추동물을 대상으로 미토콘드리아 cytochrome c oxidase I (COI)이 종을 구분하는데 유용한 유전자 마커임을 밝혔다. 또한, 생물의 정확한 종동정을 위한 방법으로 은닉 마코프 모델을 적용한 검색시스템과 종 특이적인 21-23bp의 짧은 서열을 선별하여 집적한 DNA칩을 개발하여 이들 방법의 효율성 및 정확성을 증명하였다. 정확한 종동정은 종간∙종내 유전적인 거리 차를 의미하는 바코드 갭에 크게 의존한다. 이를 수치화하여 용이한 해석이 가능하도록 했고 DNA 바코딩이 표본관련 정보를 통합하고 관리하는데 유용하게 쓰일 수 있음도 보여주었다. 마지막으로, 플랑크톤성 해양무척추동물이 혼재한 샘플을 대상으로 pyrosequencing방법을 이용한 분석방법을 소개하고 실험적인 오류 검정을 통해 생물다양성을 정확하게 파악할 수 있음을 보여주었다. 이러한 연구들을 통해서 DNA 바코드 정보의 표준적인 정보체계를 제시하며 생물 종간의 유전적 거리와 바코드 갭을 기반으로 하는 정확한 종동정과 효율적인 종동정 방법, 그리고 pyrosequencing 방법을 이용한 대량의 바코드 정보의 해석에 이르는 연구결과를 보여주었다. 이 결과들은 생물다양성 정보학에서 생물다양성 이해를 위한 연구의 기초적 발판을 제공할 뿐만 아니라 사회적인 측면에서 생물검역과 범죄수사, 식품 이물질의 판별, 유용 생물자원 발굴 및 활용에도 큰 도움이 될 것으로 기대된다.

Monitoring of microbial diversity in environment–friendly cultivation soil : 친환경 재배지의 미생물 군집상 탐색

Myoung Ho Cho 충남대학교 대학원 2011 국내석사

Microbial communities and diversities in hot pepper (Capsicum annuum L.) cultivation sites under different cultivation methods were investigated by terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) and pyrosequencing. In addition, actinobacteria were isolated from rhizosphere and tested for antagonistic activity against plant pathogenic fungi. Rhizosphere soil and leaf samples were collected from control, conventional and nature-friendly cultivation sites at Chonnam Province, Korea every month from May to July, 2009. In T-RFLP, DNAs were extracted and PCR was performed using primers FAM-799f and 1492r for amplification of bacterial 16S rDNA, and HEX-ITS1f and ITS4r for fungal ITS region, respectively. In the principal component analysis based on T-RFLP profiles, the microbial communities, including bacteria and fungi, showed a distinct difference between nature-friendly cultivation soil and other cultivation soil samples in July. However, the microbial communities from leaf samples showed no correlations between cultivation methods and microbial communities at any sampling period. The abundance of Bacillus subtilis related T-RF in soil samples increased from May to July and showed higher abundance in nature-friendly cultivation soil than in other cultivation soil samples at July. In contrast, three of 5 plant pathogenic fungi related T-RFs showed lower abundance in nature-friendly cultivation soil than in other cultivation soil samples at the same period. For pyrosequencing analysis, DNAs were extracted and PCR was performed using primers 27f and 518r for amplification of bacterial 16S rDNA variable region. The number of sequence reads containing the variable regions of 16S rDNA ranged from 4210 to 6056 for rhizosphere samples, and from 2077 to 4622 for leaf samples, respectively. The resultant data indicated that Proteobacteria was the dominant phylum in all samples, comprising 54.22 % for rhizosphere and 96.00 % for leaf samples (excepted streptophyta), of the total reads respectively. The proportion of Lysobacter among total reads ranged between 6.74 % and 10.91 % for rhizosphere, and between 46.81 % and 77.27 % for leaf samples, respectively. The Chao1 and Shannon indices ranged from 2473.49 to 3675.37 and from 6.98 to 7.34 respectively in rhizosphere soil samples, and from 226.00 to 425.68 and from 3.67 to 4.69 respectively in leaf samples. Microbial diversity and richness of all sampling sites were higher in rhizosphere soil samples. However, there was no significant difference among the sites with different cultivation methods. In rarefaction analysis, the diversity values did not decrease until the sequences reached from 4210 to 6056 and 2077 to 4622 respectively at the distance set of 3 %. For screening of antagonistic potential against plant pathogenic microbes, antimicrobial activity test was carried out against selected plant pathogens. Total 92 actinobacteria were isolated. Analysis of the 16S rRNA gene sequences indicated that 80 isolates fell into thirty distinctive phylogenetic clusters within the genus Streptomyces of the family Streptomycetaceae (87 %), 5 isolates within Nocardia, the family Nocardiaceae, 5 isolates within Actinomadura, family Thermomonosporaceae, 1 isolate within Nonomuraea, family Streptosporangiaceae, and 1 isolate within Dermacoccus, family Dermacoccaceae. The result showed that 18 strains have anti-fungal activity. However, no anti-bacterial activity could be detected. 서로 다른 방법으로 고추를 재배하였을 때 T-RFLP와 pyrosequencing 법을 이용하여 미생물의 군집상 변화를 관찰하였다. 그리고 고추의 근권 토양으로부터 방선균을 분리하여 생리 활성 시험을 수행하였다. 시료의 채취는 우리나라의 전남 나주에서 이루어 졌으며, 고추의 근권 토양과 잎을 2009년 5월, 6월 그리고 7월 세 차례 이루어 졌다. 고추 재배지는 무엇도 처리하지 않은 곳 (CT), 화학농약을 사용한 곳 (CV) 그리고 미생물제제를 이용한 곳 (NC, NL) 이렇게 네 곳이다. T-RFLP 분석은 진균과 세균으로 나누어 분석을 하였다. 세균의 경우 16S rDNA 를 FAM-799f 와 1492r primer 로 증폭하였고, 진균의 경우 ITS region 을 HEX-ITS1f 와 ITS4r 로 증폭하였다. T-RFLP 결과를 이용하여 주요인분석을 수행하였다. 시료를 채취한 달 별로 각각 분석한 결과, 근권 토양의 경우 5월과 6월의 경우 세균과 진균 모두 재배방법에 관계없이 혼재되어 있는 경향을 보였다. 하지만 7월의 경우 세균과 진균 모두 NC, NL 과 CT, CV 가 묶이는 양상을 보였다. 하지만 잎의 경우에는 어떠한 양상도 볼 수가 없었다. 미생물제제로 사용한 Bacillus subtilis 의 양적 변화를 조사한 결과, CT, CV 보다 NC, NL 에서 Bacillus subtilis 와 관련된 peak 의 양이 5월에서 7월로 감에 따라 확연히 증가하는 양상을 보였다. 이에 반하여 5가지 병원성 진균의 양적 변화를 조사한 결과 3종의 진균의 양이 NC, NL 에서 감소하는 양상을 보였다. Pyrosequencing analysis 의 경우 27f 와 518r primer 를 이용하여 증폭하였다. 각 시료마다 얻은 염기서열의 개수는 근권 토양의 경우 4210 ~ 6056, 잎의 경우 2077 ~ 4622 로 나타났다. Pyrosequencing analysis 의 문 수준에서의 분석결과 Proteobacteria 가 근권 토양에서 54.22 %, 잎에서 96.00 % 까기 매우 높은 비율로 존재하고 있었다. 속 수준에서의 분석결과 Proteobacteria 에 속하는 Lysobacter 가 근권 토양의 경우 6.74 % ~ 10.91 %, 잎의 경우 46.81 % ~ 77.27 % 매우 높은 비율로 존재하고 있었다. 또한, Chao1 와Shannon 값을 구해 보았다. 근권 토양의 Chao1 값의 경우 2473.49 ~ 3675.37, Shannon 값은 6.98 ~ 7.34 나타났으며, 잎의 경우 226.00 ~ 425.68, 3.67 ~ 4.69 으로 나타났다. 미생물의 다양성이나 풍부도 면에서 근권 토양이 잎에 비하여 상당히 높게 나타났다. 하지만 재배방법에 따라 미생물의 다양성이나 풍부도에 차이는 발견할 수 없었다. 97% 유사도를 사용하여 rarefaction analysis를 수행하였다. 다양성 지수를 나타내는 rarefaction curve 의 기울기는 모든 염기서열이 사용 될 때까지 줄어들지 않았다. 식물병원균을 억제 함으로써 미생물제제로 이용 될 수 있는 방선균을 찾기 위해 고추 근권 토양으로부터 선택적으로 분리 하였고, 생리 활성 시험을 수행하였다. 총 92개의 방선균을 분리하였으며, 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석한 결과 80종이 Streptomyces 였으며 87 % 를 차지했고, 31개의 cluster 를 형성하였다. Streptomyces, Nocardia, Actinomadura, Nonomuraea 그리고 Dermacoccus 이렇게 총 다섯 속의 방선균을 분리하였다. 이중 식물병원성 진균에 활성을 보이는 18종의 균주를 선별 할 수 있었지만, 병원성 세균에 활성을 보이는 균주는 선별 하지 못 하였다.

Pyrosequencing 방법을 이용한 한국인 혈청 paraoxonase 1(PON1) 유전자 다형성 평가

박인배 고려대학교 대학원 2012 국내석사

관상동맥질환 및 이의 합병증의 발생에는 크게 유전적 요인과 환경적 요인2가지로 분류되며 이에 따라 각분야에서 활발한 연구가 진행되어왔다. 특히 HDL 콜레스테롤 농도의 변화의 40~60%는 유전적 요인에 의해 영향을 받는다. Paraoxonase (PON)은 고밀도 지단백 (HDL) 콜레스테롤과 결합된 에스테르분해효소로 항산화, 항염 작용을 하는 것으로 알려져 있으며 저밀도 지단백 (LDL) 콜레스테롤의 산화과정으로 인한 과산화지질의 생산을 감소시켜 관상동맥경화증을 억제시키는 작용을 한다고 한다. 특히 PON1과 PON2는 유전적 다형성을 가지며 이러한 다형성은 인종과 개인에 따라 PON 활성도가 다른 것으로 알려져 있다. 따라서 저자는 pyrosequencing이라는 신속하면서도 정확한 SNP 분석 방법을 이용하여 한국인에서의 PON1 유전자 다형성을 분석하고 인종간 다형성 차이를 알아보기 위하여 본 연구를 진행하였다.

DGGE 방법과 pyrosequencing 방법을 이용한 지렁이 장내 미생물의 분포조사

김은성 연세대학교 대학원 2011 국내석사

미생물과의 상호작용을 통하여 토양의 성질을 변화시킬 수 있는 Eisenia fetida의 장내 미생물 군집을 조사하기 위하여, 배양방법과 비배양방법인 DGGE와 pyrosequencing을 이용하여 8주와 16주 사육 지렁이의 장내 미생물 군집을 분석하였다. 배양방법에서는 Lysinibacillus fusiformis (51%), Bacillus cereus (30%), Enterobacter aerogenes (21%), 그리고 L. sphaericus (15%)등이 우점하는 미생물로 확인되었다. DGGE 분석에서는 B. cereus (15.1%), Enterobacter sp. (13.6%), uncultured bacterium (13.1%), 그리고 B. stearothermophilus (7.8%)가 우점하는 미생물로 확인되었다. Pyrosequencing 분석에서는 Microbacterium soli (26%), B. cereus (10%), M. esteraromaticum (6%), 그리고 Frigoribacterium sp. (6%)가 우점하는 미생물로 확인되었으며, 이 외에 Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Borrelia sp., Cellulosimicrobium sp., Klebsiella sp., and Leifsonia sp. 등의 미생물도 확인이 되었다. 이러한 결과로 보아 비배양방법을 이용한 장내 미생물 군집 조사는 배양이 불가능한 미생물을 확인할 수 있을 뿐만 아니라 더 다양한 미생물 군집을 확인 할 수 있었고, 비배양방법에서는 DGGE 분석방법보다 pyrosequencing 분석방법에 의한 분석에서 다양한 미생물 군집을 확인 할 수 있었다.