CB-PIC sensitizes chemo-resistant cancer cells to drugs via suppression of MDR1 and its upstream signal molecules, AKT and STAT3

이덕규 경희대학교 일반대학원 2014 국내석사

MDR1 / P-glycoprotein 를 포함하는 ATP-binding cassette (ABC) transporters 는 항암제 내성 암 치료에 있어 중요하게 여겨지는 목표이다. 본 연구에서는 항암제 내성 암세포에서 MDR1의 발현을 억제하는 천연물을 조사하였다. 그 결과, 천연물 유래 합성물인 CB-PIC 가 AKT 와 STAT3 신호전달체계를 방해하여 MDR1의 발현을 억제하는 것을 MDR1 발현이 높은 paclitaxel 내성암세포주인 H460-PR 과 doxorubicin 내성암세포주인 MCF7/Adr 과 HCT15/cos 에서 확인하였다. 그러나 CB-PIC 는 MDR1의 기능인 항암제의 세포 밖 전달에는 영향을 끼치지 않는 것으로 확인하였다. CB-PIC 는 내성암세포주의 성장에 영향을 끼치고 더 나아가 세포사멸을 억제하는 단백질인 surviving, Bcl-xL, 그리고 Bcl-2 등을 억제하는 것으로 확인하였다. 결론적으로, CB-PIC 는 항암제내성암세포에서 MDR1의 발현을 억제하여 항암제특이성을 높여주고 암세포성장과 사멸에도 영향을 끼치는 것으로 확인함으로 내성암 치료의 가능성을 제시하고 있다. ATP-binding cassette (ABC) transporters including MDR1 / P-glycoprotein have been dominantly targeted for drug resistant tumor therapies. In this study, We have screened the compound that negatively affects MDR1 expression in chemo-resistant cancer cell lines. We found that CB-PIC, the novel synthetic compound, decreased P-glycoprotein expression via disrupt AKT and STAT3 signal pathway in paclitaxel resistant lung cancer cell (H460-PR), doxorubicin resistant breast cancer cell (MCF7/Adr) and colon cancer cell (HCT15/cos) with highly expressed P-glycoprotein. However, CB-PIC did not affect transport activity of P-glycoprotein, while EGCG and tannic acid accumulated Rhodamine 123 intracellular region of cell in short time efflux assay indicating direct inhibition of MDR1 transport activity. CB-PIC treatment resulted in the decrease of proliferation of drug resistant cells. In addition, CB-PIC dramatically induced apoptosis in time and dose dependent manner in both paclitaxel and doxorubicin resistant cancer cells. Furthermore, CB-PIC sensitizes drug resistant cancer cells to paclitaxel and doxorubicin by decrease of survival proteins, survivin, Bcl-xL and Bcl-2, as well as MDR1 suppression leading to accumulate the treated drug intracellular region. Taken together, CB-PIC suppresses the P-glycoprotein expression through inhibition of AKT and STAT3 signaling resulting in the increase of drug sensitivity in chemo-resistant cancer cells.

MDR1 유전자 발현조절에 영향을 미치는 요인에 관한 연구

이재동 仁濟大學校 大學院 2004 국내박사

목적 : MDR1 유전자에 의해 생산되는 약물수송단백인 P-glycoprotein(Pgp)은 개인에 따라 발현의 차이가 있고 여러 가지 약물이나 물리적 자극 등에 의해 발현이 조절된다고 알려져 있다. 본 연구에서는 인체 내에서 MDR1의 발현을 촉진한다고 알려진 갑상선 호르몬을 포함한 임상약물, 산화성 자극 등에 의해 MDR1 유전자의 발현이 변화하는지를 세포수준에서 조사하였다. 또한 새로운 발현조절 인자의 발견을 위해 cDNA array를 이용하여 항암제와 여러 종류의 자극에 의해 MDR1 유전자의 발현이 변화하는지를 조사하였다. 그리고 인체 내에서 MDR1의 발현에 영향을 주는 유전적 요소의 하나로 알려진 C3435T 유전적 다형성 분포를 한국인에서 조사하였다. 방법 : 외부물질에 의한 MDR1 유전자의 발현조절을 조사하기 위해 HepG2 세포에 갑상선 호르몬, rifampin, phenobarbital, 과산화수소, doxorubicin을 처리한 후 세포로부터 mRNA를 분리하여 RT-PCR 방법으로 발현량을 조사하였다. MDR1 유전자의 발현에 영향을 주는 자극들을 탐색하기 위해 다양한 항암제, UV선 조사, 감마선 조사, heat shock, 영양분 고갈, 단백질 합성 저해 등의 자극을 준 암세포주 cDNA array 실험을 수행하였다. 인체 MDR1 발현에 대한 유전적인 조절인자로 알려진 C3435T 변이의 경우 200명의 피험자로부터 genomic DNA를 분리한 후 PCR-RFLP방법으로 변이 유무를 검사하였다. 결과 : HepG2 세포에 갑상선 호르몬을 처리 후 MDR1의 발현을 조사하였을 때 갑상선 호르몬은 MDR1의 발현에 직접적인 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 이는 MDR1 유전자의 promoter를 이용한 luciferase assay 실험에서도 동일하게 나타났다. 반면 rifampin이나 Phenobarbital은 MDR1의 발현을 전사수준에서 증가시키는 것으로 나타났으며, 과산화수소와 같은 산화적 자극이나 항암제인 doxorubicin에 의해서도 MDR1의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. Rifampin에 의한 MDR1 발현의 증가는 16시간 이후에 나타나며 24시간에서 다시 감소하는 것으로 나타났으며, 다른 자극의 경우 시간에 따른 발현의 양상이 조금씩 차이가 있었다. 이 들 약물 이외에 MDR1 발현에 영을 주는 요인을 탐색하기 위해 cDNA array를 사용하여 조사한 결과 MDR1의 발현은 간암세포주와 위암세포주에 많이 발현되는 것으로 나타났고, 여러 가지의 항암제와 자극에 의해 발현이 조절되는 것으로 나타났다. MDR1의 발현은 세포주에 따라 차이가 있었으나 발현증가를 일으키는 자극으로는 항암제 처리, 혈청 고갈, heat shock, UV선 조사, 감마선 조사 등 다양한 것을 포함하고 있다. 인체 내에서 MDR1의 발현에 중요한 요소로 MDR1 유전자의 유전자 변이를 들 수 있는데 MDR1의 발현과 상관성이 알려진 C3435T의 경우 한국인에서 변이유전자의 빈도가 39%로 나타났다. 이러한 변이 빈도는 기타 아시아 종족과 큰 차이가 없으나 백인이나 흑인 종족과는 차이가 있음을 보여주었다. 결론 : MDR1 유전자의 발현은 rifampin, phenobarbital, doxorubicin, 과산화수소와 같은 외부의 자극에 의해 발현이 조절되는 것으로 나타났다. 또한 다양한 종류의 항암제들, heat shock, 혈청 고갈, UV선 조사, 감마선 조사 등이 암세포간 차이는 있지만 MDR1의 발현에 영향을 주는 것으로 나타났다. 이러한 환경적인 요인뿐 아니라 기능성이 있는 유전자의 변이도 한국인에서 매우 높은 빈도로 발견되었다. 이러한 결과는 MDR1의 발현이 어느 한 가지의 인자에 의해 결정되지 않고 많은 수의 서로 다른 신호전달 기전을 통해 조절됨을 시사한다. 따라서 향후 개인에 따른 MDR1 발현의 차이를 이해하기 위해서는 환경적요인과 유전적 요인을 모두 고려한 접근법이 필요할 것으로 생각된다. Objective The expression of Pgp, which is encoded by MDR1 gene, has been known to show interindividual variation and to be induced by various drugs and physical stresses. In the present study, the regulatory effects of thyroid hormone (which is known to induce MDR1 expression in vivo), clinical drugs, and oxidative stress on the MDR1 expression were investigated in cultured cell system. In addition, cDNA array experiment was performed to search for new regulatory signals for MDR1 expression among various anti-cancer agents and stresses. Finally, the frequency of functional genetic variant in MDR1 gene polymorphism causing the change of MDR1 expression in vivo was assessed in Korean population. Methods In order to investigate the regulatory effects of environmental stimuli on MDR1 expression, HepG2 cells were treated with thyroid hormone, rifampin, phenobarbital, doxorubicin, or hydrogen peroxide and analyzed for MDR1 expression by RT-PCR method. And to search for additional regulatory signals, cDNA array of various cancer cells treated with anti-cancer agents, UV irradiation, gamma irradiation, heat shock, protein synthesis inhibition, etc. was analyzed for the patterns of MDR1 expression. To assess contribution of genetic factor on MDR1 expression, MDR1 C3435T variant, that is associated with the change of MDR1 expression, was determined by PCR-RFLP method in 200 Korean subjects. Results When HepG2 cells were treated with thyroid hormone, the expression of MDR1 was not affected. This result was confirmed by luciferase-conjugated MDR1 promoter activity assay. Meanwhile, rifampin and phenobarbital induced MDR1 transcription, and oxidative stress, hydrogen peroxide, also induced the expression. The induction by rifampin was apparent at 16 hours and gradually decreased after the time. Other inducers showed different time-dependency. In order to search for novel regulatory stimuli for MDR1 expression, cDNA array was used. MDR1 expression was relatively high in liver cancer cells and colon cancer cells and was induced by various signals such as anti-cancer agents and stresses. The inducing signals includes anti-cancer agents, serum starvation, heat shock, UV irradiation, gamma irradiation, etc. though the effects of these signals on MDR1 expression varied with cell lines. The frequency of MDR1 genetic variant that has been known to associate with altered expression of MDR1 in vivo was assessed in Koreans. The frequency of C3435T variant was 39%, which is not different from those of other Asians but different from those of Caucasians and Africans. Conclusions MDR1 expression was induced by environmental factors such as rifampin, phenobarbital, doxorubicin and hydrogen peroxide. Furthermore various kinds of anticancer agents, heat shock, serum starvation, UV irradiation and gamma irradiation also induced MDR1 expression in some cancer cells. Functional genetic variation causing decreased MDR1 expression was found at high frequency in Koreans. These results suggest that MDR1 expression is under multifactorial regulation, and for better understanding the interindividual variation of MDR1 expression, the genetic factors as well as environmental factors should be considered.

Risperidone Pharmacokinetics in Relation to CYP2D6 and MDR1 in Healthy Male Korean Subjects : 한국인에 있어서 CYP2D6와 MDR1에 따른 리스페리돈의 약물동태

강현아 Graduate School, Chonnam National University 2004 국내박사

의약품들의 임상치료효과나 부작용 발생 등은 개인에 따라 차이가 발생하여 동일한 조건에서 같은 양의 약물을 투여하였을 때 개개인에 따라 혈중 약물 농도는 1000배 이상 차이가 날 수 있다. 약물반응에 었어서 이러한 차이는 나이, 성별, 환경 및 유전적 결정인자 등 수많은 요인에 의해 발생되는데 약물대사효소나 약물수송체의 유전자 변형으로 인한 차이에 기인한다는 것이 밝혀지면서 약물요법에 있어서 환자 개개인의 유전적 다양성에 대한 관심이 커지고, 약물요법에 있어서 유전적 다양성의 중요성이 크게 부각되기 시작하였다. 리스페리돈은 benzisoxazole 유도체로서 도파민 D_(2) 수용체 뿐만 아니라 세로토닌 5-HT_(2) 수용체에도 작용하여 정신분열중의 양성증상 및 음성증상 모두에 효과를 나타내며, 기타 정신질환 상태의 치료에도 효과를 나타내는 제제이다. 리스페리돈은 간에서 사이토크롬 2D6(CYP2D6)에 의해서 9-히드록시리스페리돈으로 주로 대사된다고 알려져 있다. 그리고 리스페리돈은 시험관 내 실험에서 p-당단백질(p-glycoprotein)의 기질임이 밝혀졌다. 본 연구에서는 리스페리돈 약물 체내동태의 개인간 차이가 CYP2D6와 다제내성 유전자1(multidrug resistance 1, MDR1)의 exon 21과 26에서의 유전적 다형성에 기인하는 지를 평가하여 유전형과 표현형과의 상관성을 규명하고자 하였다. 먼저, 506명과 258명의 한국인을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 기초한 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 진단법을 사용하여 CYP2D6와 MDR1 유전자의 유전형을 검색하였다. 그 중 선택된 59명의 지원자(CYP2D6*1/*1; 14명, *1/*10; 22명, *10/*10; 23명, MDR1 G2677T G/G; 26명, G/T; 27명, T/T; 6명, MDR1 C3435T C/C; 21명, C/T; 29명, T/T; 9명)에 대하여 리스페리돈 2 mg 정제를 경구 투여한 후 48시간에 걸쳐 얻은 혈청 중 리스페리돈과 9-히드록시리스페리돈의 농도를 분석하여 약물 동태 특성치를 구하였다. 그 결과, 리스페리돈의 9-히드록시리스페리돈으로의 대사는 CYP2D6*10 allele과 통계적으로 유의한 상관성이 있음을 알 수 있었다(P<0.05). 리스페리돈 약물 투여 후 1시간 까지의 흡수상 약물 농도 시간곡선하 면적과 최고 혈청 중 농도와 MDR1의 두 개의 단일염기변화와도 통계적으로 유의한 상관성이 있음을 알 수 있었다(P<0.05). 또한, CYP2D6와 MDR1의 유전형을 조합하여 분석한 결과 리스페리돈의 약물 농도 시간곡선하 면적이 통계적으로 유의한 상관성을 나타내고 있음을 알 수 있었다(P<0.01). 이를 통해 리스페리돈은 CYP2D6와 P-glycoprotein의 기질임을 알 수 있었으며, 리스페리돈의 약물동태와 대사호소 및 수송체의 유전형과는 상관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서, 약물대사효소와 수송체에서의 SNPs를 규명하는 것은 개인에 대한 맞춤약물요법 설계를 위한 유용한 방법이 될 것으로 사료되었다. Many factors, such as dietary intake, age, and concurrent drug therapies, affect a person's response to medications. Importantly, genetic makeups determine inherent pharmacokinetics, giving rise to interperson differences in drug absorption, distribution, metabolism, and excretion. SNPs in drug-metabolizing enzymes and transporters are clinically important consequence for interindividual variability in drug response. Risperidone, a benzisoxazole derevative, is a typical antipsychotic drug with extremely potent serotoin-5HT_(2) and potent dopamine-D_(2) antagonistic properties. It has a lower Potential to cause extrapyramidal symptoms compared with classical antipsychotics. Risperidone is extensively converted in the liver to various metabolites, the most important of which, 9-hydroxylation of risperidone. The CYP2D6 is involved in the 9-hydroxylation of risperidone. And, it was revealed that risperidone was a relatively good P-gp substrate in vitro. This study was to evaluate the relationship between the genetic polymorphisms in CYP2D6, MDR1 (exon 21 and 26) gene and risperidone pharmacokinetics in healthy male Korean subjects. 506 and 258 subjects were genotyped with respect to CYP2D6 and MDR1, using polymerase chain reaction-based diagnostic tests, respectively. And then, the gharrnacokinetic Profile of risperidone was examined in selected 59 subjects. Of the 59 individuals analyzed, 14 were homozygous for CYP2D6*1, and 23 for *10, while the remaining 22 subjects were heterozygous for these alleles. MDR1 G2677T genotyping revealed that homozygous wild-type (G/G), heterozygous (G/T) and homozygous mutant-tyre (T/T) was 26, 27 and 6, respectively. MDR1 C3435T genotyping revealed that homozygous wild-type (C/C), heterozygous (C/T) and homozygous mutant-type (T/T) was 21, 29 and 9, respectively. A single dose of 2 me risperidone tablet was given orally to 59 healthy male Korean subjects. Blood samples were taken during the 48 hours after the dose. Serum concentrations of risperidone and 9-hydroxyrisperidone were simultaneously measured using HPLC with UV detector. The pharmacokinetic parameters of risperidone and 9-hydroxyrisperidone such as AUC_(0-∞), Cmax, T_(l/2) and MR were significantly different among the CYP2D6*1/*1, *1/*10 and *10/*10(P<0.05). The Cmax and partial AUC of risperidone at absorption phase were significantly different among the MDR1 (G2677T and C3435T) genotype groups (P<0.05)). Also, AUC_(0-∞) of risperidone was significantly different among the combinative genotype groups of both CYP2D6 and MDR1 (P<0.01). The results indicate that risperidone is substrates for both CYP2D6 and P-gp, and the pharmacokinetics of risperidone is clearly impaired in genotypes with CYP2D6 and MDR1 SNPs. The identification of functional SNPs in metabolic enzymes and transporters may Provide a useful tool for individual therapy with drugs that are common substrates for both metabolic enzymes and transporters.

Simvastatin pharmacokinetics에 대한 MDR1 유전자 다형성의 영향

성지현 강원대학교 대학원 2008 국내석사

Simvastatin은 HMG-CoA reductase inhibitor로써 콜레스테롤 생합성 과정에서 합성 속도를 결정하는 가장 중요한 속도결정단계인 HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A)가 mevalonate로 전환되는 과정에 작용, HMG-CoA 대신 HMG-CoA reductase와 훨씬 쉽게 결합하여 mevalonate의 합성을 저해하는 매우 효과적인 competitive inhibitor로 고지혈증 치료에 가장 많이 쓰이는 약물 중 하나이다. Simvastatin은 MDR1 유전자의 exon 12번의 1236, 21번의 2677, 26번의 3435의 genotype(유전형)에 따라 콜레스테롤 저하효과와 부작용의 빈도에서 차이가 있는 것으로 발표된 바 있다. MDR1 (Multidrug-Resistance 1) 유전자는 170 kDa의 P-glycoprotein을 암호화하는 유전자이다. P-glycoprotein은 세포막에 존재하는 수송단백질의 한 종류로서 ATP를 사용하여 다양한 종류의 약물들의 세포막을 통과에 관여하는 역할과 약물을 세포내에서 바깥으로 배출시키는 역할, 그리고 세포독성을 가지거나 구조적으로 적합하지 않은 형태라고 여겨지는 약물을 소변, 담즙을 통해 배출시키는 역할을 하여 약물흡수 저해의 원인이 되기도 한다. 이에 본 논문에서는 31명의 건강한 지원자를 대상으로 Simvastatin 제제를 투여 후 혈액을 채취하여 simvastatin pharmacokinetics 분석을 시행하고 그 parameter들이 genotype에 따라 차이가 있는지 알아보았다. MDRI유전자 Exon 12번 1236, Exon26번 3435 부위에서 염기서열의 변화가 생기게 되면 Cmax(maximum plasma concentration) 및 Tmax (time to reach Cmax), 혈중 약물농도-시간 곡선 하 면적(AUC)가 증가하게 되고 생체노출시간의 증가와 함께 지속성, 생체 이용률도 높아짐을 확인할 수 있었으나 체내에서 약물의 제거가 잘 이루어지지 못하고 잔류량이 증가함을 알 수 있었다. 이는 염기서열의 변화로 인하여 MDR1에 의해 발현되는 P-glycoprotein의 활성에 차이가 생길 수 있게 된다는 것을 나타내는 것이다. 이는 MDR1 유전자에 변이가 생김으로써 pharmacokinetics parameters 의 값이 변화되었다고 판단하였고 MDR1 유전자 다형성에 의해 약물의 생체 이용률에 차이가 생길 수 있음을 알 수 있었다. 본 논문에서는 MDRI유전자 Exon 12번 1236, Exon26번 3435 유전자 다형성과 Simvastatin pharmacokinetics parameter와의 상관관계는 통계적 의미가 있었으나, Exon 21번 2677 다형성은 Simvastatin pharmacokinetics parameter와 상관관계가 없는 것으로 분석되었다. Simvastatin cholesterol lowering drugs have dramatically reduced cardiovascular disease with elevated cholesterol. The human multidrug resistance (MDR)-1 gene encodes a 170-kDa transmembrane glycoprotein(P-glycoprotein), which cinfers energy-dependent resistance to a number of structurally unrelated types of clinically useful drugs. P-glycoprotein have an important role in regulating the absorption, distribution, and excretion of simvastatin. In this study, P-glycoprotein mediated efflux of simvastatin were evaluated to assess the variation of MDR1 in drug interactions. To clarify the effects of the MDR1 gene polymorphism on simvastatin pharmacokinetics, we evaluated the effects of mdr1 genotype on simvastatin pharmacokinetics. Thirty-one healthy unrelated Korean volunteers participated in the pharmacokinetic study of simvastatin. The mean(±SD) AUC, Tmax was significantly different between 3435CC and 3435TT and 3435CT. The mean(±SD) AUC was also significantly differnet between 1236CC and 1236TT and 1236CT. These finding suggest that the polymorphic MDR1 genes is an important factor in interindividual variation in the disposition of simvastatin in human.

사람 다제내성유전자 상부 promotor의 활성도

김흥업 慶尙大學校 大學院 2004 국내박사

Background. Development of drug resistance is a major obstacle in cancer chemotherapy Cells have the general capacity to develop resistance to cytotoxic chemotherapy by various ways. One mechanism that has been found frequently is the overexpression of MDR1/Pgp. In many drug-resistant lymphoma cells, alternative transcripts with different non-coding 5' exon of MDR1 have been identified suggesting that the putative upstream promotor of MDR1 is responsible for the transcriptional regulation of the MDR1 gene after drug exposure. Until now most of all the study about the promotor of MDR1 is confined to main promoter of MDR1 and upstream promotor of MDR1 is not identified yet. Methods. In order to identify the putative upstream promotor that control alternative transcription, 5'-UTR proximal to alternative exon -1 of MDR1 was cloned by the method of Genome Walking and searched for its similar sequence at the Gene bank of TFSEARCH. The promotor activity was measured by luciferase activity after transfection of the promotor region into CHO cells. Results. Transcription start site controlled by putative upstream promotor exists 112kb upstream from exon 1 of MDR1. Gene Bank search showed that the putative upstream promotor region is within the 5^(th) intron of the LOC154661 gene encoding an unnamed protein (Model protein=XP_088000) which locates on centromeric to MDR1 gene on chromosome 7. However this gene is encoded on the antisense strand of the DNA while the MDR1 exons are encoded on the sense strand. The putative upstream promotor region showed bidirectional promotor activity and has characteristics of promotor region such as CAAT box, and numerous transcription factor binding motifs. The promotor activity in the reverse orientation is more potent than that in the orientation of MDR1 transcription. The expression of LOC154661 gene was widespread, suggesting that this may be a housekeeping gene. Conclusions. These results suggest that the putative upstream promotor of MDR1 is a gene regulatory element of neighboring gene which has bidirectional promotor activity. This suggest that the promotors or other gene regulatory sequences of house keeping genes can prime transcripts bi-directionally, Further study is warranted to explore how this aberrancy could be exaggerated with drug selection.

Single Nucleotide Polymorphisms of Multidrug Resistance Gene in Korean Epileptics : 한국 간질 환자에서 다약제 내성 유전자의 단일염기변이

金永玉 全南大學校 大學院 2005 국내박사

Purpose: P-glycoprotein 170 encoded by the multidrug resistance 1 (MDR1) gene exports various antiepileptic drugs out of the cell in the blood brain barrier, which confers multidrug resistance in epilepsy. Although there are reports indicating that some single nucleotide polymorphisms (SNPs) in MDR1 gene have been related to drug resistance, it needs to be ascertained in each ethnic group because of the ethnic diversity. This study was performed to elucidate the relationship between the known SNPs of MDR1 gene and drug resistance in some of Korean subjects with epilepsy and to reveal the genetic characteristics of the SNPs in healthy Korean population. Subjects and methods: The three known SNPs in the MDR1 gene such as T1236C in exon 12, G2677T/A in exon 21, and C3435T in exon 26 were genotyped in the enrolled 292 subjects, who were classified as ‘RS’ group (N = 96) with drug resistant epilepsy, ‘RP’ group (N = 92) with drug responsive epilepsy, and control group of the healthy Korean volunteers (N = 104). The frequencies of genotype, haplotype and combined polymorphisms (CPs, associations of genotypes of each polymorphism) at the three different positions in MDR1 gene were compared among the three groups. In addition, allele frequencies at all index sites genotype frequencies at C3435T, and haplotype frequencies were estimated in healthy Korean volunteers and compared with the data obtained from other ethnic groups. Results: At the three different positions of the MDR1 gene, the genotype frequencies had no difference among the three groups. There were 29 types of CPs in MDR1 gene, but none of which was more frequently observed in the one group than the others with statistical significance. Of 12 possible haplotypes in MDR1 gene, there was no more frequently observed type in one group than the others. For the SNPs in MDR1 gene, the healthy Korean volunteers shared similar genetic characteristics to the East Asians but showed significant difference from the Caucasians. Conclusion: For the three SNPs in MDR1 gene, there was no difference of genotype and haplotype frequencies between RS and RP group. At the position 3435 in exon 26, this result of genotype frequency was quite different from the previously reported one in some Caucasian subjects and it seemed to be caused by the ethnic difference. The current study also demonstrated the Korean genetic characteristics of the three SNPs in MDR1 gene. 목적: MDR1 유전자에 의해 발현되는 P-glycoprotein(170kDa) 막성 당단백질은 ATP 의존성으로, 혈뇌장벽에서 다양한 항경련제를 배출하는 펌프 기능을 가지고 있는데, 이로 인하여 경련성 질환에서 여러 가지 약제에 대한 내성을 초래하게 된다. MDR1 유전자의 단일염기변이(single nucleotide polymorphism) 중에는 약제 내성과 연관되어 보고된 것도 있는데, 정상인에서 이들의 빈도가 각각의 인종에 따라 현격한 차이를 보이므로, 이와 같은 보고들은 각 인종에서 다시 확인될 필요가 있다. 본 연구에서는 간질로 치료 중인 일부 한국인에서, 몇몇의 MDR1 유전자 단일염기변이와 약제 내성과의 관계를 확인해 보고, 정상 한국인에서 이들 변이의 유전적 특성을 제시하기위해 시행되었다. 대상 및 방법: 대상이 된 단일염기변이는 exon 12, 21, 26에 각각 존재하는 T1236C, G2677A/T, C3435T였으며, 이들을 등록된 188명의 경련 환자들과 104명의 정상인들에서 조사하였다. 환자들을 약제 내성군(RS group, N = 96)과 약제 반응군(RP group, N = 92)으로 분류하였고, 상기 세가지 단일염기변이의 유전자형 빈도(genotype frequency)와 단일염기변이들의 조합인 복합 단일염기변이 빈도 (frequency of combined polymorphisms) 및 단쇄염기서열 빈도(haplotype frequency)를 이들 두 환자군과 정상인군에서 비교하였다. 또한 정상 한국인들을 대상으로 이 세 가지 단일염기변이에서 대립형질 빈도(allele frequency) 및 C3435T 변이 위치에서의 유전자형 빈도와 단쇄염기서열 빈도를 조사해 기존의 타인종들에서 발표된 결과와 비교하였다. 결과: MDR1 유전자의exon 12, 21, 26에 각각 존재하는 T1236C, G2677A/T, C3435T의 세가지 단일염기변이들에서, 세 군간 유전자형의 빈도에는 큰 차이가 없었다. 대상이 된 세가지 단일염기변이의 조합에 의한 복합 단일염기변이 빈도(frequency of combined polymorphisms)는 모두 29종이 확인되었으나 그 빈도는 세 군간에 통계학적으로 유의한 차이가 없다. 단쇄 염기서열은 모두 12종이 예측되었는데, 그 빈도(haplotype frequency) 역시 세 군에서 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 정상인군에서 MDR1 유전자의 세 가지 단일염기변이들의 인종적 특성은 동아시아인과는 유사했으나, 백인과는 상당한 차이를 보였다. 결론: 한국인 간질 환자를 대상으로 한 본 연구에서, exon 12, 21, 26에 각각 존재하는 단일염기변이, T1236C, G2677A/T 및, C3435T의 빈도와 항경련제에 대한 반응 사이에 통계학적으로 유의한 연관성을 발견할 수 없었다. C3435T 변이형의 경우, 이와 같은 결과는 이미 서구에서 발표되었던 내용과는 차이를 보였는데, 이는 단일염기변이 빈도의 인종간 다양성에 기인한 것으로 사료되었다. 본 연구는 정상 한국인에서 상기 단일염기변이의 유전적 특성을 제시하였고, 이를 통해 한국인과 타인종과의 차이를 확인 할 수 있었다.

siRNA에 의한 Caco-2 cell 단층막에 발현되어 있는 MDR1의 functional silencing

김미화 서울대학교 대학원 2004 국내석사

RNA interference(RNAi)는 유전자의 발현을 post-transcriptional silencing 하는 것을 의미한다. 이러한 functional silencing 은 plants 에서 일어난다고 처음 발표되었으며 이와 비슷한 현상들이 Caenorhapditis elegance 와 fruit Drosophila 에서도 일어난다고 알려져 있다. Specific sequence silencing 은 double stranded RNA(dsRNA)와 명백한 관련이 있다. 이것은 dsRNA 가 cell 내로 도입되면 19-25 nucleotides 의 small RNAs(viz, the guide RNA 또는 small interfering RNA, siRNA)가 multiple component nuclease 인 RNA induced silencing complex(RISC)로 process 되기 때문이다. 이와 같은 RNAi 가 단백질의 기능연구에 있어서 유용한 방법입에도 불구하고 siRNA 를 이용하여 transporter 를 silencing 할 수 있는지에 대해서는 아직 알려지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 Caco-2 cell monolayers 에 발현되어 있는 MDR1 에 대해서 silencing 의 가능성을 연구해 보았다. MDR1 의 sequence 를 MDR2-MDR6 까지의 sequence 와 비교하여 MDR1 만의 specific 한 19 개의 base pair 를 선택하여 siRNA 를 합성한 후 Caco-2 cells 에 transfection 하였다. Transfection 24 시간과, 48 시간 후 MDR1 의 기질인 rhodamine123 로 transport 실험을 하였다. Stable silencing 을 위해서는 siRNA 와 상보적인 sencse-, antisense-DNA 를 합성한 후 in vitro 에서 hybridize시켰다. 이 double stranded DNA 를 Genscript vector 에 ligation 하여 Caco-2 cells에 transfection 시켰다. selection 4 주 후에 Caco-2 cells 의 functional activity 를 측정하였다. Transient silencing 의 결과 transfection 후 24시간이 지난 Caco-2 cells 에서 rhodamine123 의 vectorial transport 가 control군의 38.8%(p<0.05)까지 감소하였다. 그러나 48 시간 후엔 control 의 89.6%(p>0.05)로 회복되었다. 이것은 silencing 이 transient 하다는 것을 의미한다. 또한 이러한 결과는 선택된 siRNA sequence 가 MDR1 의 funcion 을 성공적으로 silencing 할 수 있다는 것을 의미하므로 stable silencing 의 가능성 또한 시사한다. stable silencing 의 실험결과 transfection 된 Caco-2 cells 에서 rhodamine123 의 basal 에서 apical 로의 transport 가 control 군의 27.7%(p<27.7)로 감소되었다. 이러한 결과는 Caco-2 cells 에서 MDR1 의 funtion 이 transient 한 방법과 stable 한 방법 모두로 silencing 될 수 있다는 것을 보여준다. Purpose. RNA interference (RNAi) represents post-transcriptional silencing of the gene expression. The sequence specific silencing is apparently mediated by double stranded RNA (dsRNA). While this technique is quite useful in the study the function of the protein, it is not known whether silencing of transporters by siRNA is feasible. We have aimed to study the feasibility of MDR1 silencing in Caco-2 cell monolayers Methods. Based on the comparison of sequences for transporters that showed a significant homology, a nucleotide sequence with 19 base pairs, specific for MDR1, was selected and the corresponding siRNA synthesized. The resulting double stranded siRNA was transfected to Caco-2 cells by the standard method. The vectorial transport of rhodamine 123, a typical MDR1 substrate, was studied 24 and 48 hrs after the transfection. When it was necessary to study the stable silencing of the transporter, sense and antisense DNA of the complementary sequence of the siRNA were separately synthesized and hybridized in vitro; the resulting double stranded DNA was ligated to Genscript vector and subsequently transfected to Caco-2 cells. Four weeks after the selection, the functional activity was determined in the Caco-2 cells. Results. In the transient silencing study, the vectorial transport of rhodamine 123 was reduced in the transfected cells (33.8 % of the control, p<0.05) in 24 hrs. However, the transport was reverted back to the control level (86.6 % of the control) in 48hrs of the transfection, indicating that the silencing was indeed transient. Since this observation indicated that the sequence we have selected was able to silence the MDR1 function, we have studied whether stable silencing was feasible for MDR1 in Caco-2 cells. After four weeks of the transfection, the basal to apical transport of rhodamine 123 was significantly depressed (27.7 % of the control, p<0.01) in the transfected cells. Conclusions. These observations indicated that functional silencing, in both transient and stable manners, for MDR1 activity is feasible in Caco-2 cells.

The Effects of MDR1, CYP3A4, and CYP3A5 Gene Polymorphisms on the Population Pharmacokinetics of Cyclosporine in Non-steady-state Renal Transplant Recipients : 신이식 초기에 MDR1, CYP3A4, CYP3A5 유전자 다형태가 사이클로스포린 (cyclosporine)의 집단 약동학적 지표에 미치

Baek, Hyun Jeong 성균관대학교 일반대학원 2009 국내박사

이식 환자에서 MDR1, CYP3A4, CYP3A5 유전자 다형태가 사이클로스포린 (cyclosporine)의 약동학적 지표에 미치는 영향에 관한 기존의 연구들은 대부분 이식 후 3개월이 지난 비교적 안정된 상태에서의 환자들을 대상으로 연구한 것이었다. 하지만 이식 직후 환자들에서는 이러한 영향에 관한 연구가 빈약한 실정이다. 본 연구에서는 신이식 직후 2, 3일에 사이클로스포린의 약동학적 지표가 어떻게 변하는지를 알아보고, 또한 MDR1, CYP3A4, CYP3A5 유전자 다형태가 이러한 약동학적 지표에 어떤 영향을 미치는지에 대해서 알아보고자 하였다. 또한 이식 직후에 적절한 약물 용량을 결정하기 위한 지표로 area under curve (AUC0-12)와 가장 연관성을 보이는 약물 농도를 구하고자 하였다. 총 69명의 생체 신이식 환자를 대상으로 이식 후 2일과 3일째 집단 약동학적 지표를 구하였으며, nonlinear mixed-effect modeling (NONMEM) 방법을 이용하였다. 중합효소연쇄반응 및 DNA sequencing 방법을 이용하여 MDR1, CYP3A4, CYP3A5 유전자 다형태를 분석하였다. 약동학적 모델에서 이식 후 2일째에 비해 3일째에 absorption rate constant와 bioavailability가 현저하게 증가하였다. 이러한 변화는 MDR1 동종접합 야생형 군에서 돌연변이 형질을 하나 이상 가지고 있는 군에서보다 현저하였다. 다른 유전자 다형태는 약동학적 지표에 영향을 미치지 않았으며, volume of distribution, systemic clearance, absorption lag time은 2일과 3일째 차이를 보이지 않았다. 이식 후 2일째 AUC0-12 값과 가장 높은 연관성을 보인 약물 농도는 약물 투여 후 8시간째 농도이었고, MDR1 양 군에서 동일한 결과를 보였다. 3일째에서는 MDR1 동종접합 야생형 군에서는 6시간째 농도가, 돌연변이 형질 군에서는 8시간째 농도가 가장 높은 연관성을 보였다. 이식 직후 환자들의 약동학적 지표는 매우 불안정하여 이식 후 2일과 3일째에 다른 값들을 보여 주었으며, 2일째보다 3일째에 약물의 흡수와 관련된 여러 가지 지표들이 호전됨을 알 수 있었다. 이러한 차이는 MDR1 유전자 다형태에 영향을 받는 것을 알 수 있었다. 또한 기존에 안정된 상태에 있는 환자들의 약물 용량을 결정하기 위해 사용하였던 투여 직전 농도 혹은 투여 2시간 후 농도를 이식 초기 환자들에서 동일하게 사용한다면 부적절한 면역억제를 유발할 가능성이 있다. Background: Many studies have investigated the relationships between the pharmacokinetics (PK) of cyclosporine (CsA) and genetic polymorphisms of MDR1, CYP3A4, and CYP3A5 in stable-state renal transplant recipients. However, information is lacking on the corresponding relationships in the early, non-steady-state post-transplantation period. Objective: The main objectives were elucidation of the changes in the PK parameters of CsA in the first 2-3 days post-transplantation, and the influences of MDR1, CYP3A4, and CYP3A5 polymorphisms. We also estimated the optimal correlating single time-point concentration with AUC0-12, which may be useful as a target drug concentration for monitoring during the early post-transplantation period. Methods: The PK of CsA was studied in 69 renal transplant recipients on Day 2 and Day 3 after transplantation using nonlinear mixed-effects modeling (NONMEM). The patients were genotyped for the MDR1 C3435T, CYP3A4*1B, and CYP3A5*3 single nucleotide polymorphisms (SNPs). Correlation analysis was performed to identify the single time-point that best correlated with AUC0-12. Results: The PK model showed significant increases in the absorption rate constant (Ka) and bioavailability on Day 3, as compared to Day 2. There were no significant daily changes in the volume of distribution, systemic clearance, and absorption lag time. Only the MDR1 C3435T genotype affected an increase in Ka. Homozygous wild-type individuals (N=24) showed a more pronounced increase in Ka between Day 2 and Day 3 than mutant-allele carriers (N=45) (P = 0.0065). The single time-point best correlated with AUC0-12 occurred 8 h after the administration of CsA (C8) in both groups on Day 2 and in the mutant-allele carriers on Day 3. C6 was the optimal single time-point in patients with wild-type MDR1 on Day 3. Conclusion: In the non-steady state immediately after renal transplantation, the absorption and bioavailability of CsA increased more prominently on Day 3 than on Day 2, and the increase in absorption was greater in MDR1 wild-type patients. Also, C0 or C2 monitoring to adjust the dosage of CsA may result in inadequate immunosuppression during the early post-transplantation period.

약물 대사효소 및 수송체 유전형과 aspirin 병용투약이 clopidogrel의 약동학/약력학에 미치는 영향을 평가하기 위한 건강자원자 대상 임상시험

홍경섭 서울대학교 대학원 2016 국내박사

아스피린 복용에 따른 MDR1 유전자의 발현 증가로 인해 MDR1의 기질 약물인 클로피도그렐의 흡수가 감소하였다는 보고가 있었고, 아스피린 병용 시 클로피도그렐의 효능 저하에 따른 치료 실패 가능성에 대한 우려가 있다. 본 연구에서는 전구 약물인 클로피도그렐의 대사에 관여하는 CYP2C19 유전형 및 MDR1 발현에 영향을 미치는 것으로 알려진 C3435T 유전형 별 남성 건강대상자 15명을 모집한 후 8주간 아스피린 복용 후 인체 십이지장 점막에서의 MDR1 발현 정도를 최초로 평가하였고, MDR1 발현과 클로피도그렐 및 H4활성대사체의 약동학 및 약력학 간의 관련성을 평가하였다. 결과로서 아스피린 복용 후 C3435T CC/CT 유전형에서는 MDR1 발현이 증가한 반면 TT군에서는 변화가 없거나 오히려 감소하였다. CC/CT군 및 TT군에서 공통적으로 아스피린 복용 전후에 클로피도그렐의 전신노출 정도에 유의한 차이는 없었다. 반면 H4 활성대사체의 경우 아스피린 투약 후 EM-CC/CT군에서 통계적으로 유의하게 감소하였지만 relative platelet inhibition으로 평가한 약력학 분석에서는 차이가 없었다. EM_TT군 및 PM_CC/CT군에서는 통계적으로 유의하지는 않았지만 H4 활성대사체가 증가하는 양상을 보였다. 결론적으로 아스피린 복용 후 MDR1 C3435T CC/CT군에서 MDR1 발현이 증가하였음에도 불구하고 클로피도그렐 및 H4 활성대사체의 전신노출 정도는 감소하지 않았다. 아스피린과 클로피도그렐의 병용 투약은 EM_CC/CT, EM_TT 혹은 PM_CC/CT군에서 효과적인 조합이라 생각된다.

Rat mdr1a(p-glycoprotein)의 cloning과 이를 발현하는 MDCK cell line의 구축

이인영 서울대학교 대학원 2014 국내석사

약물수송체(Drug transporter)는 여러 장기에 분포되어 있으며, 약물의 흡수, 분포와 배설에 크게 기여한다. 또한 약물수송체를 유도하거나 저해하는 약물상호작용(Drug-drug interaction)은 약물 대사의 변화에 중요한 역할을 한다. 이 때문에 미국 FDA는 약물상호작용에 많은 영향을 미치는 약물수송체 7가지를 선정하여, 신약개발 과정에서 후보물질이 이들 수송체의 기질 혹은 저해제로 작용하는지 조사단계가 필요하다고 명시하고 있다. 약물상호작용은 in vivo 상으로 관찰하는 것이 가장 정확하나, 비용도 많이 들뿐더러 위험하므로 그에 앞선 in vitro 실험으로 불필요한 in vivo 실험을 방지할 필요가 있다. 따라서 rat의 in vitro 약물상호작용 평가 체계가 구축되어 있다면 rat과 human의 in vitro 자료의 상관성을 이용하여, 직접적으로 구하기 힘든 human에서의 in vivo 상호작용 결과를 예측하는데 큰 도움이 될 것으로 기대된다. 본 실험에서는 그러므로 FDA 선정 7가지 수송체 중 하나인 MDR1 (P-glycoprotein)에 해당하는 rat에서의 mdr1a를 cloning 하기로 하였다. Rat mdr1a가 많이 발현 된 liver RNA로부터 Reverse transcription과 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 통해 mdr1a를 coding하는 부분을 증폭시켰다. 그리고 PCR을 통해 얻은 mdr1a DNA를 pcDNA5/FRT vector 내로 cloning 하였다. 완성된 rat mdr1a clone을 MDCK II/FRT cell에 transient하게 transfection하였고, RT-PCR을 통하여 mRNA 발현을 확인하였다. 이어서 function study를 하였는데, mock cell과 mdr1a transfected MDCK II/FRT cell 간에 유의적인 function의 차이를 관찰하지 못하였다. 여러 원인이 존재할 수 있는데, 이를 보완하면 stable한 rat mdr1a-MDCK II/FRT cell line을 확보할 수 있을 것이라 생각된다. 확보한 rat mdr1a cell line은 후에 신약개발단계에서 약물상호작용 평가에 쓰일 수 있을 것으로 기대된다.