Functional study of DNA methylation and histone ubiquitination in regulating tumor cell differentiation and proliferation

박준영 중앙대학교 대학원 2024 국내박사

DNA 메칠화는 유전자 발현을 조절하는 후성학적 수식화의 한 종류로써 혈액 생성 과정에서 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. UHRF1과 DNMT1은 DNA 메칠화가 유지되는데 있어서 중요한 역할을 한다. 특히, 급성 골수성 백혈병에서는 DNA의 전반적인 저메칠화가 중요한 특징 중 하나로 나타난다. 하지만 DNA 메칠화가 THP-1 세포주를 포함한 급성 골수성 백혈병 세포의 분화 과정을 어떻게 조절하는지에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 PMA에 의한 THP-1 세포의 분화 과정에서 UHRF1과 DNMT1을 포함한 DNA 메칠화 관련 유전자의 발현이 크게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, UHRF1과 DNMT1의 발현을 억제한 상태에서 분화를 유도하는 경우, THP-1 세포의 분화가 촉진되는 것을 확인하였고, 그 과정에서 비교군에 비해 분화된 대식세포를 활성화시키는 것으로 알려진 TNF-α, IL-1β, IL-6와 같은 염증 촉진성 사이토카인의 발현 및 분비가 촉진되는 것을 확인하였다. 전사체 분석 및 유전체 수준의 DNA 메칠화 분석을 통해 UHRF1 또는 DNMT1의 발현 억제가 PMA에 의한 THP-1 세포의 분화를 촉진하는 방향으로의 변화를 유도한다는 것을 확인하였다. 또한 UHRF1 또는 DNMT1의 발현을 억제한 경우, THP-1 세포로부터 유래한 고형 종양의 성장이 생쥐 내에서 억제되는 것을 확인하였다. 본 연구를 통해 UHRF1과 DNMT1이 THP-1 세포의 분화 및 분화된 대식세포의 활성화를 조절하는데 중요한 역할을 하고 있음을 규명하였다. 또한 백혈병 세포의 분화를 촉진시키는 기작을 이용하여 급성 골수성 백혈병 환자들에게 적용할 수 있는 분화 치료의 효율을 올릴 수 있는 방법을 제시하였다. 구체적으로, UHRF1과 DNMT1이 백혈병 세포의 분화 관련 유전자의 발현을 억제하고 있음을 근거로 UHRF1 또는 DNMT1에 대한 억제제 처리 또는 발현 조절을 통해 백혈병 세포의 정상 세포로의 분화 과정을 촉진할 수 있는 가능성을 제시하였다. SET/TAF-Iβ는 아세틸화 효소에 대한 억제제로 작용하는 INHAT 복합체의 한 구성요소로 알려져 있으며, 히스톤 아세틸화를 억제함으로써 전사 억제에 관여한다. SET/TAF-Iβ는 이 외에도 종양 억제 유전자인 p53의 아세틸화를 조절하는 등 다양한 기능을 가지고 있으며, 다양한 암에서 발현이 높은 것이 알려져 있다. MIB1은 본 연구에서 SET/TAF-Iβ와 상호작용하는 단백질로 새롭게 발견되었다. MIB1은 유비퀴틴화 반응에 관여하는 E3 효소이고, Notch 단백질에 결합하는 Delta 수용체를 유비퀴틴화 시켜 결과적으로 프로테아좀에 의한 분해가 일어나게 함으로써 Notch 신호 전달 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 DAPK1의 유비퀴틴화에도 관여하여 TNF에 의한 세포사멸을 촉진하는 것도 알려져 있다. 본 연구에서는 SET/TAF-Iβ의 과발현에 의해서 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기의 유비퀴틴화가 증가하는 것을 발견하였다. 질량 분석을 통해 SET/TAF-Iβ와 상호작용하는 새로운 단백질로써 MIB1을 발견하였고, 시험관내 시험을 통해 SET/TAF-Iβ와 MIB1이 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기에 유비퀴틴화를 유도할 수 있음을 확인하였다. 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기의 유비퀴틴화를 일으키는 것으로는 PRC1의 RING1B가 잘 알려져 있다. RING1B에 의한 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기의 유비퀴틴화는 PRC2에 의한 히스톤 H3의 라이신 27번 메칠화와 함께 전사 억제에 큰 역할을 한다. 본 연구에서 밝혀낸 SET/TAF-Iβ과 MIB1에 의한 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기의 유비퀴틴화는 PRC1에 의한 유비퀴틴화와 독립적으로 DNA 복제 및 세포 주기 관련 특정 여러 유전자에서 전사를 조절하고 있음을 확인하였다. 또한 전사체 분석을 통해 SET/TAF-Iβ와 MIB1이 DNA 복제 및 세포 주기 관련 유전자들의 발현을 조절하고 있음을 규명하였다. 실제로 SET/TAF-Iβ와 MIB1에 의해 발현이 변한 유전자들의 프로모터 부위에서 SET/TAF-Iβ 또는 MIB1의 발현 억제에 의해 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기의 유비퀴틴화가 감소함을 확인하였다. 또한, SET/TAF-Iβ 또는 MIB1의 발현 억제가 대장암 세포주인 HCT116 세포의 생장을 크게 억제하는 것을 확인하였고, 이 과정에서 유세포 분석기를 통해 세포 주기가 제대로 진행되지 못하고 G1기에서 S기로 넘어가는 과정에 문제가 생기는 것을 확인하였다. 본 연구는 전사를 조절하는 것으로 잘 알려진 히스톤 수식화인 히스톤 H2A의 119번 라이신 잔기의 유비퀴틴화를 조절하는 새로운 기작을 규명하였다. DNA methylation is an epigenetic modification that regulates gene expression and plays an essential role in hematopoiesis. Ubiquitin-like PHD and RING finger domain-containing protein 1 (UHRF1) and DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 (DNMT1) are both crucial for regulating genome-wide maintenance of DNA methylation. It is widely accepted that promoter methylation is associated with transcriptional repression and gene body methylation is associated with transcriptional activation. Specifically, it is well known that hypermethylation is crucial characteristic of acute myeloid leukemia (AML). Dysregulation of DNA methylation is considered as an important factor which is involved in initiation and progression of leukemia including AML. Particularly, acute monocytic leukemia (AMoL), which is a subtype of AML, is caused by uncontrolled proliferation of monocytes and differentiation of those monocytes are suppressed. The correlation between aberrant DNA methylation and pathogenesis of leukemia is well-established, however, the mechanism underlying how DNA methylation regulates the differentiation of AML cells, including THP-1, is not fully elucidated. In PART I study, I reported that expression levels of UHRF1 or DNMT1 dramatically decreased after phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) treatment in THP-1 cells. Moreover, UHRF1 or DNMT1 depletion enhances the PMA-induced differentiation of THP-1 cells. In addition, expression and secretion of cytokines which induce M1 polarization of differentiated macrophages, such as tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), increased when differentiation was induced in UHRF1- or DNMT1-depleted THP-1 cells. Transcriptome analysis and genome-wide methylation array results showed that depleting UHRF1 or DNMT1 induced changes that made THP-1 cells highly sensitive to PMA. Furthermore, knockdown of UHRF1 or DNMT1 impeded solid tumor formation in xenograft mouse model. These findings suggest that UHRF1 and DNMT1 play a pivotal role in regulating differentiation and proliferation of THP-1 cells and targeting these proteins may improve the efficiency of differentiation therapy in AML patients. Protein SET/template activating factor I β isoform (SET/TAF-Iβ), a subunit of the inhibitor of acetyltransferases (INHAT) complex, exhibits transcriptional repression activity by inhibiting histone acetylation. Multitasking protein SET/TAF-Iβ is frequently overexpressed in cancers and is well-known proto-oncogene. SET/TAF-Iβ also regulates acetylation of non-histone proteins including tumor suppressor p53. Mind bomb homolog 1 (MIB1), which I discovered as a new interaction partner of SET/TAF-Iβ, is an E3 ligase. MIB1 is highly conserved across species. MIB1 is known to regulate Notch signaling pathway by ubiquitinating Delta receptors which binds to Notch proteins. Also, MIB1-mediated ubiquitination and proteasomal degradation of death-associated protein kinase 1 (DAPK1) promotes TNF-induced apoptosis. Mono-ubiquitination of histone H2A at lysine 119 (H2AK119ub) is one of the well-known histone modifications which regulate transcription. H2AK119ub is catalyzed by polycomb repressive complex 1 (PRC1) and is a representative transcriptional repression marker. H2AK119ub is accompanied by tri-methylation of histone H3 at lysine 27 (H3K27me3), which is catalyzed by polycomb repressive complex 2 (PRC2), results in strong transcriptional repressive activity. In PART II study, I reported that overexpression of SET/TAF-Iβ upregulated H2AK119ub in HCT116 cells. Furthermore, I identified that MIB1 is the E3 ligase partner for SET/TAF-Iβ using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Also, purified SET/TAF-Iβ and MIB1 mediated in vitro ubiquitination of histone H2A at lysine 119. Transcriptome analysis revealed that SET/TAF-Iβ and MIB1 regulate the expression of genes related to DNA replication and cell cycle progression in HCT116 cells. In addition, knockdown of either protein reduced proliferation of HCT116 cells by impeding cell cycle progression. Together, this study reveals a novel PRC1-independent epigenetic regulatory mechanism for H2AK119ub by SET/TAF-Iβ and MIB1 in HCT116 colon cancer cells.

유방암의 재발 여부를 예측할 수 있는 특정 유전자의 DNA 메칠화 레벨

이미리 동아대학교 대학원 2011 국내박사

유방암의 치료방법은 나날이 발전해 왔지만 새로운 예후인자의 필요성은 증대되었다. DNA 메칠화는 종양의 발생과 진행에 중요한 역할을 하기 때문에 DNA 메칠화를 기반으로 한 생물지표(biomarker)는 예후인자로써의 역할을 할 수 있다. 우리는 수술이 가능한 유방암 환자의 여러 가지 DNA의 메칠화 수준을 정량적으로 분석하기 위해 pyrosequencing 방법을 이용하였다. 121명의 냉동 신선 유방암 조직을 가지고 pyrosequencing 방법을 이용하여 20개 유전자의 DNA 메칠화 수준을 측정하였다. 임상병리학적 특성들과의 상호관계를 분석하였다; 본 연구의 최종목표는 DNA 메칠화 자료와 무재발 생존기간과의 생존분석이었다. 추적기간의 중앙값은 5.1 년이었다; 25명의 환자(21%)가 재발하였다. 대부분의 유전자는 임상병리학적 특성과는 상관 관계가 없었다. 단변량 변수 분석 결과 임파절 상태, 유전자 HLAa, NKX 2-5, PDLIM4, SERPINB5, SFN, SLIT2, TWIST1의 메칠화는 통계적으로 매우 유의한 예후인자이지만, 조직학적 등급은 통계적 유의성은 없었다. Akaike Information Criteria(AIC)를 적용한 다변량 변수 분석 결과 SERPINB5를 제외한 모든 변수들, 즉 임파절 상태(p=0.013), 조직학적 등급(p=0.037), HLAa(p=0.007), NKX 2-5 (p=0.004), SLIT2(p=0.018)가 무재발 생존기간과 통계적 유의성을 보였다. 이 세 가지 유전자는 임파절 상태, 조직학적 등급에 비해 상대 위험도가 높았다. 임파절 상태, 조직학적 등급, 유전자를 통합하여 분석한 R-score (AUC = 0.9)가 임파절 상태와 조직학적 등급만을 분석한 R-score 에 비해 더 효율성이 높았다. 본 연구는 DNA 메칠화 수준을 pyrosequencing 방법을 이용하여 정확하고 정량적으로 측정함으로써 유방암 환자의 일부 유전자가 유방암의 재발을 예측할 수 있음을 확인하였다. 이 유전자들은 임상병리학적 특성들과 상호관련성이 있을 것으로 생각되며, 더 큰 규모의 연구가 필요할 것으로 생각된다.

DNA methylation as a biomarker for environmental exposures

우해동 서울대학교 대학원 2010 국내박사