현사시(Populus alba x P. glandulosa) CCoAOMT 유전자 분리 및 구조 특성

이용섭 建國大學校 大學院 2000 국내박사

생물체의 유전자 확보가 중요시되는 이때, 특히 산업적인 이용도가 높은 유전자의 확보는 연구의 필수적인 요소가 되고 있다. 식물의 경우, Arabidopsis thaliana, 콩, 벼 등에서 연구된 유전자의 정보를 바탕으로 보다 쉽게 유전자 분리가 가능하게 되었다. 리그닌 합성 역시 관심이 높아지는 대사로 나자식물과 피자식물의 PAL, COMT, 4CL 등에서 많이 연구되었다. 수목의 경우, 리그닌과 관련된 대사조절은 경제적 및 환경 친화적인 측면에서 그 중요성이 높아지고 있다. 그러나, 이와 같은 경제적인 가치가 높은 유전자를 분리하기 위해서는 많은 경비의 지출과 시간을 필요로 한다. 본 실험은 이러한 단점을 극복하려는 시도로 RT-PCR방법을 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 현사시의 CCoAOMT 유전자를 분리하기 위하여 기존에 염기서열이 결정된 CCoAOMTdb전자를 토대로 primer를 만들어 RT-PCR을 실시하였다. 0.75 Kb의 증폭된 반응물을 얻어서 이를 subcloning 하였다. 이 유전자의 염기서열은 fluorescent dye방법에 의해 결정하였다. 유전자로부터 만들어진 단백질은 247개로 아미노산으로 구성되며 M.W.는 27450 Da 이다. 다른 CCoAOMT 유전자들과 PCGENE software를 이용하여 염기서열의 유사성을 분석한 결과 Populus tremuloides 와 96.1%, Populus balsamifera와는 95%의 상동성을 확인하였다. 분석된 염기배열은 다른 식물의 CCoAOMT 염기배열과 유사성조사를 하여 Vitis vinifera와 82.4%, Nicotiana tabacum와 79%, Petroselinum crispum와 80%, Pinus taeda와 72%, Zea mays와 69.5%의 상동성이 확인되었다. 번역된 putative CCoAOMT cDNA는 아미노산 유사성 조사에서 Vitis vinifera와 90.9%, Nicotiana tabacum와 91.3%, Populus basamifera와 96.4%, Populus tremuloides와 96.8%, Petroselinum crispum와 87.1%, Pinus taeda와 78.1%, Zea mays와 80.2%으로 다른 식물의 CCoAOMT 유전자와 높은 유사성을 보였다. Putative CCoAOMT의 아미노산 배열은 CCoAOMT의 SAM domain 부분과 일치하는 domain A, B, C, D, F, E, F, G, H가 확인되었다. 또한, 메탈이온인 Mg^(2+)이 결합하는 ligand도 조사되었다. 이러한 결과는 RT-PCR방법을 이용하여 분리된 cDNA가 현사시 CCoAOMT임을 보여주고 있다. There have been many attempts to manipulate the secondary metabolism of plants. These attempts are based on the information from the research of the model plant organisms such as Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, and Oriza sativa. The genomic information from the organisms can be applied to the economically important plants. However, the information has hardly been used for the breeding work of trees. One of the potential applications of the molecular techniques to tree improvement may be the manipulation of lignin contents by modulating its biosynthetic pathway in trees. To manipulate the pathway, however, we need the genes that control the steps in the pathway. So far the genes involved in the lignin biosynthetic pathway have been mostly identified. Therefore, the molecular approaches have focused on both reducing pulping cost and waste materials, and improving wood quality by either sense or antisense suppression. However, the efficiency of both sense and antisense suppression is known to depend upon the degree of sequence homology. Therefore, if we are to control gene expression by such suppression approaches, we need to have the genes that are identified or close to identify to those of the target plants. To modify lignin contents of tree that are native to Korea, we need to isolate the genes from the from the trees in Korea. Therefore, in the present study, attempts were made to isolate the gene encoding CCoAOMT from Populus alba x P. glandulosa by RT-PCR and to characterize the gene by comparing both DNA and polypeptide sequences with other homologous genes of different origins. The following results were obtained ; 1. A primer set was deduced and synthesized to flank CCoAOMT gene from poplar based on the published sequences of Populus tremuloides. 2. RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) was performed using mRNA extracted from the stems of 1 year old Populus alba x P. glandulosa The band in size of about 0.75 Kb was isolated and cloned into a PCR cloning vector. The sequence analyzed by BLAST of NCBI (National Center of Biotechnology Information) revealed that it had a high homology of 96.1 % with the CCoAOMT gene of Populus tremuloides and 2.7 KDa in molecular weight. 3. The putative CCoAOMT genes identified in the present work shows 82.4% homology in nucleotide sequence with that of Vitis vinifera CCoAOMT, 79% with Nicotiana tabacum, 95% with Populus basamifera, 96.1% with Populus tremuloides , 80% with Petroselinum crispum, 72% with Pinus taeda, and 69.5% with Zea mays. 4. The deduced amino acid sequence of P. alba x P. gladulosa CCoAOMT shows 90.9% homology with that of Vitis vinifera CCoAOMT, 91.3% with Nicotiana tabacum, 96.4% with Populus basamifera, 96.8% with Populus tremuloides, 87.1% with Petroselinum crispum, 78.1% with Pinus taeda, and 80.2% with Zea mays. 5. The deduced CCoAOMT has SAM domain A, B, C, D, E, F, G, and H and metal binding amino acids as reported in other plants. Therefore, based on the analyses in the present study, it could be concluded that the cloned sequence from P. alba x P. glandulosa was indeed CCoAOMT gene.

Improved lignin contents of phragmites communis with molecular approach

이정은 서울시립대학교 2011 국내석사

본 연구는 최근 바이오에너지의 원료로 각광받고 있는 갈대의 조직배양 기술 및 대량생산 기술과, 리그닌 생합성에 관련하는 갈대 특이적 COMT 와 AOMT유전자를 분리, 그리고 갈대의 형질전환법 확립과 더불어 리그닌의 함량을 낮추어 보다 바이오에너지 원료로서의 이용성을 증대시킨 갈대 형질전환체의 획득에 관한 것이다. 갈대의 callus 유기는 아직 갈대의 연구에서 보고된 바 없는 4-FA 함유배지에서 가장 좋은 결과를 보였으며, 갈대의 재분화에서는 NAA와 BAP의 차이가 클 때 (NAA 0.5mg/L, BA 2mg/L) 좋은 재분화율을 보였다. 습지식물인 갈대는 고체배지보다 액체배지에서의 성장이 월등히 좋았으며, 대량생산 적용 시 최적 sucrose의 농도는 60g/L로 확인되었다. 리그닌 생합성에 관련하는 Phenylpropanoid pathway 상의 중요 효소인 COMT와 AOMT의 유전자를 분리하였다. 조직별 COMT유전자와 AOMT 유전자의 발현을 mRNA레벨에서 조사한 결과, 뿌리와 잎에서 높은 발현량을 보였으며, 줄기와 뿌리줄기에서 낮은 발현량을 보였다. 또한 시기별 분석에서 AOMT는 노화여부와 상관없이 거의 일정한 발현을 보였지만, COMT는 노화가 진행될수록 크게 증가함을 보였다. 또한 COMT와 AOMT는 호르몬 등의 생장조절물질의 처리에서 2,4-D 처리와 자스몬산, 살리실산에 크게 반응하였다. 한 식물의 이용성 증대를 위해서는 형질전환법의 확립이 우선되는 문제라 할 수 있다. 하지만 아직 갈대에 대한 형질전환법은 보고된 바가 없다. Part4에서는 Agrobacterium tumefaciens를 이용한 갈대의 형질전환에 성공하여, GUS gene의 발현을 RNA 레벨과 단백질 레벨에서 확인하였고, callus 단계에서의 염색에도 성공하였다. 또한 part4의 주요목적인 COMT 와 AOMT의 RNA interferencing을 통한 lignin 저하 역시 RNA 레벨에서 확인하였다. 본 실험에서는 갈대 작물에서 처음으로 lignin 생합성 관련유전자인 COMT 와 AOMT를 분리하였고, 이는 바이오에너지 작물로 각광받는 갈대의 연구에 이용될 수 있으리라 생각한다. 또한, 아직 보고된 바 없는 갈대의 형질전환법 역시 앞으로의 갈대 작물의 이용성 증대에 작은 도움이 되리라 생각된다. Reed grass (Pragmites communis Trin.) is one of the widely distributed perennial grass species in the world living in a wide variant environment, especially in wet land. Recently it has been expected to be the raw material of bio-energy which can be supplied stably with lingo-cellulose without effects on food resources. However, there is seldom methodical research on reed. An in vitro culture system for the large-scale propagation of Phragmites communis Trin. (common reed) was established in part I by optimizing culturing conditions for callus induction and differentiation along with plant propagation using regenerated plantlets. Callus formation was induced from stem segments with callus induction medium containing auxin 4-fluorophenoxyacetic acid (4-FA) or 2,4-dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D). A high frequency of callus induction was observed when applied for the first time on 4-FA 1.0 mg L-1 medium (up to 93%). Regeneration system for reed was studied. The highest regeneration capacity was associated with the medium containing 0.05 mg L-1 NAA and 2 mg L-1 BA, and the combination of 0.2 mg L-1 NAA and 2 mg L-1 BA. These regeneration and propagation systems could be used for mass propagation or an in vitro culture system. The Caffeic acid O-methyltransferase (COMT) and Caffeoyl CoA O-methyltransferase (CCoAOMT) of Phragmites communis Trin. (common reed) were studied in part Ⅱ. COMT and CCoAOMT are important genes for lignin biosynthesis. COMT and CCoAOMT were found and showed high affinity with amino acid sequences of other gramineous plant’s COMT and CCoAOMT. The deduced protein sequence from cDNA shares homology with the reported gramineous plants. Southern analysis indicates that multi gene codes for both two enzyme in reed. COMT and CCoAOMT exist in distinct organs, and the highest expression level of two enzymes was observed in root and leaf. Temporal expression of these enzyme analysis showed that the expression level of CCoAOMT was gradually increased expression level while COMT was ascended steeply as developmental stage proceeded in reed. Agrobacterium tumefiaciens mediated transformation is a widely used transformation method in various plants. Despite the recent attention on reed as a bio-energy resource, transformation of reed has been not reported yet. Transformation system for reed was reported in part Ⅳ. Callus originated from Phragmites communis Trin. was used for transformation. The CaMV 35S promoter inserted pCAMBIA 1381 vector was transformed in callus mediated by Agrobacterium tumefaciens. Generated green embryos in selection medium were stained for verifying expressed GUS gene. The GUS transgenic plants were ascertained on RNA expression level and protein expression level also. Caffeic acid O-methyltransferase (COMT) and Caffeoyl CoA O-methyltransferase (CCoAOMT) involved in phenylpropanoid pathway play a crucial role in lignin biosynthesis. After establishing transformation procedure of reed, COMT and CCoAOMT deficient transgenic plants were produced. The transgenic plants were showed severely decreased lignin level and some of transformants showed dwarfism caused by insufficient lignin.