Development of cartilage tissue engineering applications using mesenchymal stem cells

조혜란 인천대학교 일반대학원 2019 국내석사

Osteoarthritis (OA) is a common chronic disease caused damage on focal area of the articular cartilage and caused by extreme exercise and aging. Current surgical treatments for OA had a series of disadvantages such as fibrocartilaginous tissue formation and donor site morbidity. Therefore, in order to overcome these problems, researchers developed advanced treatments with the aid of mesenchymal stem cell (MSCs) including (bone-marrow derived stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cell (ADSCs)). Recent stem cell therapies based on tissue engineering and regenerative medicine have been developed combining with scaffolds and exogenous growth factors. MSC has self renewal ability and multipotency that can differentiate into bone/cartilage tissue, and is well known for pro-inflammatory effect within inner body conditions. Additionally MSC can be isolated easily from bone-marrow or adipose tissue with high yields. Therefore, it has been used as a common cell source utilized under various conditions in tissue engineering. For enhanced stem cell differentiation, exogenous growth factors (GFs) are administrated by using various delivery carriers (i.e., micelle, liposome, synthetic polymeric platform etc.). Especially, transforming growth factor-beta family (TGF-β) and insulin-like growth factor (IGF) are widely used as an exogenous growth factor for chondrogenesis of stem cell. IGF-1 and TGF- β could enhance the chondrogenesis of stem cells by developing morphological changes and inducing excretion of extracellular matrix (ECM) components. Hence, tissue engineering strategies for chondrogenesis of stem cells have been developed by varying (1) cell culture methods, (2) exogenous biological cues, (3) composition of ingredients, and (4) modification of scaffolds. This article summarized engineering applications for cartilage regeneration using stem cells, by suggesting (1) co-culture stratgies using MSC and chondrocytes, (2) recent clinical trials for ADSC-mediated joint repair, and (3) optimization of serum types (i.e., bovine serum (BS), new-born calf serum (NCS)) for enhanced chondrogenesis of ADSC. Administration of a single cell population of either stem cells or chondrocytes does not guarantee a full recovery of cartilage defects. Therefore, current tissue engineering approaches using co-culture techniques have been developed to mimic complex and dynamic cellular interactions in native cartilage tissues and facilitate changes in cellular phenotypes into chondrogenesis. Therefore, this article introduces recently developed co-culture systems using two major cell populations of, MSCs and chondrocytes. Furthermore, the present article also summarizes the recent clinical applications utilizing ADSC and its clinical and therapeutic efficacy which evaluated by scoring systems for OA treatment. Current ADSC treatments in clinical system have been developed by direct injection of ADSC with additional compounds such as platelet-rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) for enhancing differentiation of stem cells. In addition, optimization of serum types for a large-scale stem cell production/culture is also critical parameter to develop a cost-effective and biologically functional chondrogenesis process. Fetal bovine serum (FBS) is the most essential supplement in culture media for cellular proliferation, metabolism, and differentiation. However, due to a limited supply and subsequently rising prices, a series of studies have investigated a biological feasibility of replaceable serums to substitute FBS. Along with the increasing interests to manufacture stem cell-based cellular products, optimizing the composition of culture media including serums and exogenous GFs is of importance. Hence, the effect of BS and NCS on proliferation and chondrogenic differentiation capacity of human ADSCs was evaluated, especially in the chondrogenically supplemented culture condition. Our findings demonstrated that (1) co-culture methods using stem cells with chondrocytes could effectively augment chondrogenesis and stem cell differentiation as compared with monoculture, (2) clinical ADSC treatment could be an effective cell therapy by improving physical function of damaged cartilage sites, and (3) serum types and exogenous supplements of GFs could also be important parameters to optimize culture media composition, especially in order to maintain the enhanced levels of both proliferation and chondrogenic differentiation of ADSCs during expansion. Therefore, it could be speculated that stem cell therapy utilizing stem cell population could be an effective OA treatment in tissue engineering and regenerative medicine. 골관절염은 흔한 만성 질환으로 관절 연골의 국소 부위에 손상을 주며 심한 운동과 노화로 인해 생기는 질병이다. 관절의 특성상 한번 다치면 회복되기 어렵다는 점으로 인해, 관절을 치료하기 위해서는 물리적, 외과적 방법들이 이용되고 있다. 현재 사용하고 있는 골관절염의 치료 방법들은 (미세 천공술, 관절세포 이식 등) 공여 부위의 또 다른 관절염 유발이 된다는 것과 섬유조직으로 잘못 재생되는 것과 같은 많은 단점을 가지고 있다. 따라서 이 문제를 극복하기 위해 연구자들은 앞서서 중간엽 줄기 세포와 지방 세포 유래 줄기 세포를 활용한 치료법을 개발했다. 중간엽 줄기 세포는 뼈 / 연골 조직으로 분화 할 수 있는 능력과 자가 재생 능력을 가지고 있으며, 신체 내부에 이식 되었을 때에는 염증을 억제하는 효과까지 있다고 잘 알려져 있다. 또한 중간엽 줄기 세포는 혈액이나 지방 조직으로부터 쉽게 분리 될 수 있고 그 수율 또한 다른 줄기세포에 비해 높다는 장점으로 인해 조직 공학 분야의 다양한 조건에서 활용되는 일반적인 세포원으로 사용되어왔다. 줄기 세포의 분화 가능성을 높여 주기 위해, 일반적으로 많은 연구가 다양한 전달 매체 (엑소좀, 리포솜, 합성 중합체 등)에 외인성 성장 인자를 담지 하여, 줄기세포와 함께 투여한다. 특히, 줄기 세포의 연골 형성을 위한 외인성 성장 인자로는 형질전환생장인자-베타 계열과 인슐린 유사 성장 인자가 널리 사용된다. 이전의 많은 연구에서 형태학적 변화를 일으키고 세포 외 기질 성분의 배설을 유도함으로써 줄기 세포의 연골 형성을 향상시킬 수 있는 인슐린 유사 성장 인자와 형질전환생장인자-베타의 효능을 제안했고, 따라서 줄기 세포를 활용한 연골 형성 전략은 (1) 세포 배양 방법, (2) 외인성 성장 인자의 첨가, (3) 성분 조성의 변화, (4) 지지체의 개발과 같은 방향으로 개발되었다. 이 논문에서는 (1) 중간엽 줄기 세포와 연골 세포를 이용한 공동 배양법, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용한 임상 시험 및 결과, 그리고 (3) 중간엽 줄기세포를 이용한 연골 재생 전략을 요약하고 소개하고 있다. (1)에서는 줄기 세포 또는 연골 세포와 같은 단일 유형의 세포 집단을 환부에 투여한다고 해서 연골 결손의 완전한 회복이 보장되는 것은 아니다. 따라서 공동 배양 기술을 사용하는 조직 공학적 접근법은 생체 연골 조직에서의 복잡하고 역동적인 세포 상호 작용을 모방하고 있으며, 세포 표현형의 연골 형성으로의 변화를 촉진하기 위해 개발되었다. 따라서 이 주제는 최근에 개발 된 두 가지 주요 세포 집단 (중간엽 줄기 세포 두 종류와 연골 세포 등)을 이용한 공동 배양 시스템을 소개한다. 다른 한편, (2) 지방 세포 유래 줄기 세포는 손상된 연골 부위를 치료하기 위해 임상 분야에서 이용되어 왔다. 이 부분에서는 지방 세포 유래 줄기 세포를 이용하여 임상에 적용시켰다. 채점 시스템으로 평가 하여 임상 효능을 요약했다. 또한 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위해 혈소판 풍부 혈장 및 지방조직 유래 세포기질 분획과 같은 추가 화합물을 지방 세포 유래 줄기 세포와 주사하여 임상 시스템에서의 현재 지방 세포 유래 줄기 세포 치료법이 개발되었다. 또한 송아지 혈청과 소 혈청을 사용하여 다른 접근 방식을 도입했다. (3)에서는 혈청에 따른 지방 세포 유래 줄기 세포의 연골 세포로의 분화 효과를 확인하기 위해, 송아지 혈청과 소 혈청을 처리하여 기존에 사용하고 있는 소 태아 혈청과 비교하였다. 소 태아 혈청은 세포 증식, 신진 대사 및 분화를 위한 배양 배지에서 가장 필수적인 보충 물이다. 그러나 제한적인 공급과 그에 따른 가격 상승으로 인해 일련의 연구가 소 태아 혈청을 대체 할 수 있는 대체 가능한 혈청의 생물학적 타당성을 연구했다. 줄기 세포 기반 세포 제품을 제조하는 데 대한 관심 증가와 함께 혈청 및 외인성 성장인자를 포함한 배양 배지의 조성을 최적화하는 것이 중요하다고 여겨지고 있어, 이 실험에서 인간 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식 및 연골 분화 능력에 대한 송아지 혈청과 소 혈청의 효과가 평가되었으며, 특히 연골 보충 배양 조건에서 평가되었다. 연구 결과 (1) 연골 세포를 이용한 줄기 세포를 이용한 공 배양 방법이 단일 배양법에 비해 줄기 세포 분화에 효과적인 연골 형성이 될 수 있음, (2) 줄기 세포를 이용한 임상에서의 지방 세포 유래 줄기 세포 치료가 통증, (3) 송아지 혈청과 소 혈청은 소 태아 혈청과 비교하여 지방 세포 유래 줄기 세포의 증식에는 영향을 미쳤지만, 연골 세포로의 분화 분석한 결과에서는 기존의 혈청과 차이가 나지 않았다. 이러한 연구결과들은 다양한 연골재생치료제의 개발 방향에 많은 단서를 던져주고 있고, 따라서 지방 세포 유래 줄기 세포 혹은 골수유래 중간엽 줄기세포를 이용한 줄기 세포 치료가 향후에 효과적인 골관절염 치료가 될 수 있음을 시사한다.

TGF-β1 처치한 지방조직 유래 줄기세포 상층액이 상처치유, 섬유아세포 이주 및 제 1형 교원질 발현에 미치는 효과

강민철 계명대학교 대학원 2011 국내박사

지방조직 유래 줄기세포를 배양한 상층액이 교원질 합성과 섬유아세포의 세포 이주를 촉진하는 기능이 있음이 밝혀짐으로써, 향후 지방조직 유래 줄기세포 배양액이 상처치유와 항노화에 널리 이용될 것으로 기대되고 있다. 교원질 합성을 촉진하고 섬유아세포의 세포 이주를 촉진하는 사이토카인으로 transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1)이 잘 알려져 있는데, TGF-β1을 지방조직 유래 줄기세포에 처치하고 회수한 상층액에는 처치하기 전에 비하여 더 많은 성장인자들이 포함되어 있을 가능성이 있다. 이 연구에서는 TGF-β1을 처치한 지방조직 유래 줄기세포의 상층액이 처치하지 않은 지방조직 유래 줄기세포 상층액보다 더 효과적으로 섬유아세포의 세포 분열, 세포 이주, 제1형 교원질, matrix metalloproteinase-1 (MMP-1)의 발현 및 in vivo 실험에서 무모생쥐 등의 상처치유를 촉진하는지에 대하여 연구하고자 한다. 이를 위하여 TGF-β1 (1 ng/mL)을 지방조직 유래 줄기세포에 처치하고 24 시간 뒤 배양액을 회수하여 이를 섬유아세포에 처치하고 RT-PCR 및 Western blot 기법을 사용하여 분석하였다. 또한 무모생쥐 등에 4 mm 펀치를 사용하여 일정한 크기로 상처를 만들고, 상처에 TGF-β1을 처치한 지방조직 유래 줄기세포를 배양한 상층액을 상처 부위에 주사하여 상처치유 촉진 효과를 확인하고자 하였다. 본 연구의 결과 TGF-β1을 처치한 지방조직 유래 줄기세포 상층액이 처치하지 않은 상층액보다 더 효과적으로 섬유아세포의 세포 분열 및 세포 이주를 촉진하였다. 제 1형 교원질 및 MMP-1의 발현은 증가하였으나, G1/S 단계로의 이행을 촉진하는 세포주기 조절자의 발현은 현저히 증가시키지 않았다. 또한 4 mm 펀치로 만든 무모생쥐 등의 상처도 TGF-β1 처치한 지방조직 유래 줄기세포 상층액을 주사한 경우 상처 치유가 촉진되었다. 그러므로 TGF-β1을 처치한 지방조직 유래 줄기세포 상층액은 섬유아세포의 세포 분열 및 세포 이주를 촉진시키고 제 1형 교원질 및 MMP-1 의 발현을 증가시킴으로써 피부 상처 치유를 촉진시킨다고 생각되며, 이는 향후 상처치유 촉진제 개발에 중요한 자료가 되리라 생각한다. Conditioned medium from adipose-derived stem cells (ADSCs) stimulates both collagen synthesis and migration of dermal fibroblasts, thereby conditioned media from ADSCs (ADSCs-CM) will be a promising agent for wound healing and anti-aging. TGF-β1 plays important roles in induction of type I collagen expression and migration of fibroblasts. However, it is still unknown whether the conditioned media from TGF-β1-treated ADSC (TGF-β1-treated ADSCs-CM) induce expressions of type I collagen and matrix metalloproteniase-1 (MMP-1) as well as cell cycle regulatory proteins, and cell migration effectly in fibroblasts, compared to ADSCs-CM. The purpose of this study is to investigate the effect of TGF-β1 -treated ADSCs-CM on fibroblasts cell proliferation rates, cell migration, and expressions of type I collagen and MMP-1. In addition wound healing accelerating effect of TGF-β1-treated ADSCs-CM was studied using hairless mice. Regular artificial wounds were made on mice back by 4 mm punch, and TGF-β1-treated ADSCs-CM was injected around wounds by 2 times per week. Data of this study showed that TGF-β1 -treated ADSCs-CM promoted more effectively the migration of human skin fibroblasts and cell proliferation, compared to ADSCs-CM. The expressions of type I collagen and MMP-1 under treatment of TGF-β1 -treated ADSCs-CM were more increased than those of type I collagen and MMP-1 under treatment of ADSCs-CM. in fibroblasts The expressions of cell cycle regulators of G1/S phase transition were not markedly altered by treatment of TGF-β1-treated ADSCs-CM. In addition artificial wound were made using 4 mm punch biopsy in hairless mice and TGF-β1-treated ADSCs-CM were injected into wound area. The intradermal injection of TGF-β1-treated ADSCs-CM promoted wound healing process in hairless mouse. In conclusion, this study showed that TGF-β1-treated ADSCs-CM induced up-regulation of expression of both type I collagen and MMP-1 promoted the migration of skin fibroblasts, cell proliferation, and wound healing process in vivo, thereby these results may give key fundamental data for developing a wound healing accelerating agent.

DNA-binding Cell-penetrating Peptide-based TRAIL Over-expression in Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cells Inhibits Glioma U251MG Growth

신재식 연세대학교 일반대학원 2021 국내박사

연구 배경 및 목적: 비바이러스 벡터를 이용한 줄기 세포의 유전적 조작은 낮은 형질 감염 효율로 인해 여전히 제한적이다. 이번 연구에서 DNA 결합 세포투과펩타이드(CPP)가 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)에서 비바이러스 벡터의 형질감염 효율을 향상시킬 수 있는지, 그리고 세포투과펩타이드(CPP)를 통해 TRAIL을 과발현하는 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)가 세포 실험 및 동물 실험에서의 신경교종 U251MG의 성장을 억제할 수 있는지 연구하였다. 재료 및 방법: 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)는 CPP, PCMV3-TRAIL 및 지질기반 형질감염시약(X-tremeGENE)을 사용하여 TRAIL을 과발현하도록 유전적으로 조작하였다. 결과: 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)의 형질감염 효율은 세포투과펩타이드(CPP)를 사용하여 약 7% 증가하였다. 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)의 53.9%가 형질감염 되었고 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)에서 TRAIL 발현이 지질 기반 형질감염 물질(X-tremeGENE) 단독 사용에 비해 최대 3배 증가하였다. 세포투과펩타이드(CPP)를 사용하여 TRAIL을 과발현하는 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)는 세포 실험 및 U251MG 이종 이식 모델 모두에서 신경교종 U251MG의 성장을 억제하였다. 결론: 세포투과펩타이드(CPP)는 지방조직유래 중간엽 줄기세포(ASC)를 유전적으로 조작하여 종양을 치료하기 위한 증폭자로 사용할 수 있을 것으로 사료된다. Background/Aim: Genetic manipulation of stem cells using non-viral vectors is still limited due to low transfection efficiency. We investigated whether the DNA-binding cell-permeation peptides (CPP) can enhance the transfection efficiency of non-viral vectors in adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs) and whether ASCs over-expressing TRAIL through CPP can inhibit the growth of glioma U251MG cells in vitro and in vivo. Materials and Methods: ASCs were genetically engineered to over-express TRAIL by using CPP, pCMV3-TRAIL and lipid-based transfection reagents (X-tremeGENE). Results: The transfection efficiency of ASCs increased by approximately 7% using CPP; 53.9% of ASCs were transfected and TRAIL expression in ASCs increased by approximately 3 times compared to X-tremeGENE alone. ASCs over-expressing TRAIL using CPP inhibited growth of glioma U251MG cells both in vitro and in the U251MG xenograft model. Conclusion: CPP can be used as an enhancer for genetically manipulating ASCs and tumor treatment.

生體에서 Alginate gel 내 人體脂肪組織由來 줄기細胞의 軟骨化 : In vivo Chondrogenesis of Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Alginate Gel

권용석 동아대학교 대학원 2009 국내박사

외상이나 종양 또는 대사성 질환으로 인한 연골 손상 후 재생과 치유는 현재까지 중요한 임상 분야 중 하나이다. 지방조직 유래 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells)는 근골격계 조직 공학에 접근하는 중요한 근본 세포주 중 하나이다. 본 연구는 생체에서 alginate gel 내 transforming growth factors beta 3(TGF-β3) 와 hyaluronic acid(HA)를 이용하여 지방조직 유래 줄기세포에서 연골생성의 가능성에 대해 알아보고자 하였다. 먼저 인간의 피하지방층에서 분리한 지방조직 유래 줄기세포를 중간엽 세포 배지에 넣어 확장시켰다. 3 계대 배양된 세포는 Wright Giemsa 염색과 FACS (fluorescence activated cell sorter)를 사용한 백혈구 고유 면역 단백복합체 (CD; cluster differentiation)를 확인하여 중간엽 줄기세포임을 확인하였다. 실험은 대조군과 4개의 실험군으로 나누어 시행되었으며, 모든 실험군은 alginate gel을 포함하였다. 제 1 실험군은 중간엽 줄기세포(S)만으로 구성되고, 제 2 실험군은 중간엽 줄기세포(S)와 TGF-β3, 제 3실험군은 중간엽 줄기세포(S)와 HA, 그리고 제 4 실험군 은 중간엽 줄기세포(S)와 TGF-β3와 HA로 구성되었다. 실험은 SCID (severe combined immunodeficient) mice에 각각의 alginate gel 복합체를 피하층에 주입하여 3주 후에 RT-PCR과 조직학적 분석을 통해 연골 생성을 확인하였다. 교원질의 면역조직화학 검사와 Safranin-O 염색에서 제 4 실험군 (S + HA + TGF)에서 가장 많은 제 2형 콜라겐과 프로테오글리칸(proteoglycan)이 생성되었음을 확인할 수 있었다. 한편, HA가 포함된 실험군 (S + HA, S + HA + TGF) 에서는 제 1형과 10 형 collagen의 생성이 현저히 감소되었음을 관찰할 수 있었다. 하지만 예상과 다르게 RT-PCR 결과에서 collagen II 와 aggrecan의 특이 유전자 표지자를 찾지 못하였다. 본 실험에서 저자는 생체내에서 transforming growth factor beat 3 (TGF-β3) 와 hyaluronic acid (HA) 는 지방조직 유래 줄기세포에서 연골계열의 세포로 분화시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 연골재생을 위한 실제적이고 새로운 기술이 발전될 수 있도록 더 많은 연구가 필요하다고 생각되어진다. The regeneration and repair of cartilage after trauma, cancer, or metabolic disorders is still a major clinical challenge. Through developmental plasticity, adipose tissue-derived stem cells (ADSCs) are important seed cells for the musculoskeletal tissue engineering approach. This study sought to examine the chondrogenic potential of ADSCs induced by human transforming growth factors beta3 (TGF-β3) and hyaluronic acid (HA) in vivo. After isolation from subcutaneous adipose tissue, ADSCs were expanded in mesenchymal medium. Third generation subcultured mesenchymally differenciated ADSCs were vertified by Wright Giemsa stain and CD identification with FACS (fluorescence activated cell sorter). The experimental groups were divided into 5 groups. All groups included alginate gel. Group I consisted of only mesenchymal stem cells (S), Group II, mesenchymal cells to which TGF-β3 ( S + TGF) was added, Group III, mesenchymal cells with hyaluronic acid added (S + HA), and Group IV, mesenchymal cells to which both components were added. (S + HA + TGF) Control groups (C) consisted of similar polymer formulations but without cells. SCID (severe combined immunodeficient) mice were injected subcutaneously with polymerized alginate solution containing mesenchymal stem cells with transforming growth factor β3 (TGF-β3), hyaluronic acid (HA), or both. Three weeks after implantation, cartilage formation was evaluated by histologic analysis and RT-PCR. Safranin-O and immunohistochemitry showed the greatest production of proteoglycan and collagen type II which suggests chondrogenic matrix in Group IV (S + HA + TGF). The significantly lower production of collagen type I and X was founded in the constructs containing HA groups (S + HA, S + HA+ TGF). In RT-PCR test, the expression of the chondrocyte marker genes, type II collagen and aggrecan were not detected in any group. These findings demonstrated that TGF-β3 and HA could induce ADSCs into a chondrogenic lineage in vivo. This lay the foundation for further optimization of a novel and practical technology for cartilage reconstruction.

척수손상 백서에서 인체지방조직유래 중간엽 줄기세포 이식이 신경회복에 미치는 영향

손세위 동아대학교 2006 국내박사

척수좌상 백서에서 인체 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 척수 손상부위에 이식한 후 주입한 세포의 생존을 관찰하고, 운동기능의 개선 여부를 알아보고자 연구를 시행하였다. 체중 250-350g의 암컷 Sprague-Dawley계 백서 30마리를 15마리씩 대조 손상 군과 중간엽 줄기세포를 이식한 군으로 나누었다. 척수좌상 1주째에 남성 인체지방조직유래 중간엽 줄기세포를 척수 손상부위에 이식하고 이후 9주째까지 운동 기능의 회복을 Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) locomotor rating scale 및 백서가 중심을 유지하면서 미끄러지지 않은 최대 각도(inclined angle)를 이용하여 확인한 결과, 줄기세포를 이식한 군에서 대조 손상 군에 비해 유의한 운동 기능의 회복을 보였다. 형태학적 검사 결과 역시 대조 손상 군에서 비 전형적 탐식세포의 침투, 축삭 변성, 부종, 척수 공동형성 등의 소견이 줄기세포 이식 군에 비해 보다 심한 양상을 보였으며, 척수 횡단면에 대한 잔여 회백질의 비율도 줄기세포 이식 군에서 대조 손상 군에 비해 유의하게 높았다. 이식되어진 줄기세포의 생존여부 및 신경계 세포로의 발현 여부를 관찰하기 위해 fluorescent in situ hybridization 법을 시행하였으며 Y 염색체 양성 세포를 일부에서 입증하였다. 본 연구의 결과는 향후 줄기세포 연구에서 골수유래 줄기세포의 대체자원으로서 지방조직유래 중간엽 줄기세포의 가능성을 제시할 것으로 사료된다.

탈무기 골기질과 지방조직 유래 줄기세포로 구성된 막상 뼈 대체제를 이용한 두개골 재건에 대한 연구

표세영 인제대학교 2008 국내석사

목적 : 뼈 재생용 생체재료의 유용성을 증가시키기 위해 조직공학적 방법이 이용되고 있다. 조골세포로 분화할 수 있는 조골전구세포를 생분해성 지지체 (scaffold)에 함입시키고, 이식 전 체외에서 조골세포로 분화를 유도하여 제조한 조직공학적 대체재는 뼈 재생을 유도할 수 있다. 본 연구는 탈무기 골기질 (demineralized bone matrix, DBM), 지방조직 유래의 줄기세포 (adipose tissue-derived stem cells, ASCs)와 피브린 (fibrin)으로 구성된 막상 뼈 대체재를 제조하고, 이렇게 제조된 대체재의 뼈 재생능력을 두개골 결손모델을 통하여 연구하였다. 방법 : 쥐 (Sprague Dawley rats)의 피하 지방조직으로부터 ASCs을 분리하였고, 분리한 ASCs가 뼈, 지방, 근육으로 분화되는 능력을 규명하고자 하였다. 또한 DBM과 ASCs의 배양을 통하여 DBM의 골유도 및 골전도 능력을 규명하고자 하였다. DBM의 ASCs에 대한 뼈로의 분화유도 능력은 분화를 유도한 세포 내 alkaline phosphatase (ALP) 활성도를 측정하여 조사하였다. 최적의 피브리노겐 농도를 규명하기 위하여 ASCs와 DBM은 4가지 농도 (0.25, 0.5, 1.0, 1.5%)의 피브리노겐과 500 mUnit/ml의 thrombin으로 구성된 피브린 내로 함입시켜 2일간 배양한 후 세포의 filamentous-actin (F-actin)의 형성도를 조사하였다. 6 mm 크기의 두개골 결손부위를 만든 다음, 그 결손부위에 DBM/피브린/ASCs로 구성된 합성물을 이식한 쥐 (3군), DBM/피브린 합성물을 이식한 쥐 (2군)와 어떠한 대체재도 사용하지 않은 쥐로 구성된 대조군 (1군) 사이에 뼈 재생 정도를 비교하여 분석하였다. 신생골의 형성 정도는 방사선학적 방법과 조직학적 방법을 통하여 분석하였다. 결과 : 쥐의 피하 지방에서부터 분리한 줄기세포는 뼈, 지방, 근육으로 분화할 수 있는 능력이 있었다. DBM 투여에 따라 ASCs의 ALP 활성도는 DBM 용량과 비례하여 증가하였다. DBM은 ASCs의 부착과 성장을 지지할 수 있는 기질로서 역할을 담당하는 것을 확인할 수 있었다. 피브리노겐 농도에 따라 ASCs의 F-actin 형성은 영향을 받으며, 생리적 농도의 피브리노겐 (0.25%, 0.5%)으로 제조한 피브린은 ASCs가 보다 빠른 F-actin 형성을 지지하는 것을 확인할 수 있었다. 시술 4주 후에 DBM/피브린/ ASCs로 구성된 막상 뼈 대체재로 치료받은 쥐는 DBM/피브린 합성물로 치료받은 쥐 혹은 대조군과 비교하여 뼈 재생능력이 가장 우수하였다 (p < 0.05). 결론 : DBM은 ASCs를 효과적으로 조골세포로 분화를 유도할 수 있으며, DBM, 피브린 그리고 ASCs로 구성된 막상 대체재는 임상적인 두개골 재생 목적을 위하여 유용하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 중심단어 : 지방조직 유래 줄기세포, 피브린, 탈무기 골기질, 막상 인공 뼈 대체재, 골재생, 두개골 재건

Development of hydrogel scaffolds for adipose tissue regeneration

김수진 서울대학교 대학원 2021 국내박사

Hydrogel is a polymer network loading with water or hydrophilic biological fluid. As the hydrogel network structure comprises porous structures, hydrogel carries growth factors, drugs and cells as a scaffold. Hydrogel has a modulus from several kPa to MPa, and soft hydrogel, which has a low modulus, is suitable for making a hydrogel scaffold for soft tissue engineering. The key concept developed in the paper was to design and synthesize a soft hydrogel-based scaffold with several kPa modulus optimized for adipose tissue, and a study was conducted to be clinically applicable. Part 1 is the research about synthesis of hydrogel filler by acrylamide and HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate) copolymerization with EGDMA(ethyleneglycoldimethacrylate) as a crosslinker by one-step redox polymerization with ester bonding. As the poly(HEMA-Am) hydrogel is crosslinked with an ester group, the poly(HEMA-Am) hydrogel degradation was lowered in vivo than natural polymer hydrogel, including hyaluronic acid due to structural stability. The poly(HEMA-Am) hydrogel structure was designed to exclude a secondary amine structure that causes toxicity in vivo compared with the conventional acrylamide-based filler for improving biocompatibility. We confirmed several kPa modulus of poly(HEMA-Am) hydrogel similar to conventional acrylamide-based filler by rheometer. The results suggest that biocompatibility and physical property of poly(HEMA-Am) hydrogel is suitable to restore loss of adipose tissue in vivo for large-scale adipose tissue reconstruction. In part 2, We developed alginate-based scaffolds optimized for autologous fat grafts. Alginate-adipose tissue scaffold was developed by mixing alginate solution and human derived adipose tissue and crosslinking by calcium ion. The alginate-adipose tissue scaffold was synthesized similar to the modulus of alginate tissue by controlling the concentration of alginate solution and the ratio of alginate and the adipose tissue. The alginate-adipose tissue scaffold was designed to prevent necrosis of adipose tissue and protect adipose tissue in vivo for autologous fat graft with a small amount of adipose tissue. The adipose tissue in the scaffold releases adipokines by the porous structure of the scaffold and induces the surrounding adipose tissue regeneration of the insertion site. The research of part 3 is a synthesis of a thermosensitive hydrogel scaffold by acrylamide and poloxamer 407 copolymers. Poloxamer 407 was modified by methacrylic anhydride and copolymerized acrylamide as a crosslinker, then synthesize Am-poloxamer 407 hydrogel scaffold to improve the maintenance and stability of structure because poloxamer 407 is degraded in few days when injected to subcutaneous. The scaffold increase modulus at a temperature of 37℃ in the body temperature range at a low concentration to 10 w/v%. The scaffold volume remains until 4 weeks in vivo experiment and stably settled in vivo though highly affected by the external environment and gravity. Adipose-derived stem cells were loaded on the scaffold to improve adipose regeneration ability and confirmed biocompatibility and differentiation ability within the scaffold of ADSCs. In conclusion, a hydrogel scaffold, specialized for adipose tissue regeneration and reconstruction, was synthesized using various polymers, including synthetic polymers including acrylamide, HEMA, poloxamer 407, and natural polymer alginate. We designed hydrogel scaffolds with ADSCs and adipose tissue to promote the regeneration of surrounding adipose tissue. Unlike conventional adipose tissue engineering, hydrogel scaffolds optimized for the properties and properties of adipose tissue regeneration mechanisms were developed, contributing to the development of future adipose tissue engineering research. Synthesized hydrogel scaffolds have high biocompatibility and structural stability in vivo, are compatible with and induce regeneration of surrounding adipose tissues in vivo. Our research showed that the hydrogel scaffold synthesized in this study could be applied to soft tissue engineering, biomolecule delivery systems, cell scaffolds, and regeneration and reconstruction of adipose tissue. 수화젤은 물과 친수성 체액을 담지 하는 고흡수성 고분자로 물성을 다양하게 조절 할 수 있고, 생체 내 습윤환경에서 잘 적응 할 수 있으며, 다공성 구조를 가지고 있기 때문에 다양한 세포 및 분화 인자, 약물을 운반 할 수 있다는 특성으로 인해 지방 조직 공학에서 스캐폴드 로서 훌륭한 재료이다. 논문에서 개발된 핵심 개념은 지방조직에 최적화된 수십 kPa modulus를 가진 연조직 기반 다기능성 수화젤 스캐폴드를 설계하여 합성하였고, 임상적으로 적용 가능하도록 개발하는 연구를 진행 하였다. 우선 이 목표를 달성하기 위해 acrylamide와 HEMA(2-hydroxyethylmethacrylate)를 EGDMA(ethyleneglycoldimethacrylate)로 one-step redox polymerization으로 공중합 및 가교하여 에스터 결합으로 수화젤을 합성하였다. 합성한 poly(HEMA-Am) hydrogel은 주입가능한 특성으로 합성하여 임상에서 필러로 사용하고자 설계하였고, 지방조직에 특화된 물성으로 생체 내 지방 조직의 손실의 다양한 부위를 유연하게 수복한다. 또한, 에스터 그룹으로 가교 하여 천연 고분자 수화젤 보다 생체 내 구조적 안정성을 높여 분해도를 낮추었다. 이러한 에스터 구조는 안전성 및 독성이 있는 이차 아민 구조를 고분자 내 구조에서 배재하도록 설계하여 생체적합성을 향상시켜 대용량을 주입하여도 안전하도록 합성하였다. 또한, 알긴산 용액과 지방조직을 혼합하여 칼슘 이온으로 가교 하여 자가지방이식술에 최적화 된 alginate-adipose tissue scaffold를 합성하였다. 지방조직과 가장 유사한 물성을 조절하고자 알긴산 용액의 농도 및 지방조직과의 비율을 조절하여 지방조직과 가장 유사한 물성의 스캐폴드를 합성하였다. 합성한 alginate-adipose tissue scaffold는 지방조직의 괴사를 방지하고 보호하고, 적은 양의 지방조직으로 자가지방이식술을 가능할 수 있도록 설계하였다. 또한, 스캐폴드 내부의 지방조직이 스캐폴드의 다공성 구조를 통해 아디포카인을 외부로 방출하여 주변의 지방 조직 재생을 유도하도록 개발하였다. 지방조직의 생체 내 유지와 안정성 및 지방재생능을 실질적으로 보다 향상시키기 위해 체온 범위의 37℃ 온도에서 물성이 지방조직에 적합하도록 증가하는 수화젤 스캐폴드의 합성을 설계하였다. 온도감응성 물질인 poloxamer 407과 지방조직 재생에 많이 활용되는 acrylamide를 기반으로 온도감응성 수화젤 스캐폴드를 합성하였다. Poloxamer 407을 methacrylate로 양 말단에 이중결합을 결합한 후, 변형된 poloxamer 407을 가교제로 acrylamide와 공중합하여 온도감응성 수화젤을 중합하였다. 수화젤에 가교제로 사용된 poloxamer 407은 10 w/v%의 낮은 농도로 온도에 따른 물성변화를 나타낸다. 또한, poloxamer 407 단독으로 사용되었을 때, 가역적 졸-젤 변이로 생체 내 낮은 안정성과 높은 분해도를 acrylamide와 공중합을 통해 안정적으로 생체 내부에 주변 지방조직과 유동적으로 자리잡는다. 이는 대용량의 지방조직 재생이나 외부의 환경 및 중력에 영향을 많이 받는 지방조직의 특성상 생체 내에서 안정성 있게 자리잡을 수 있도록 하는 특성이다. 또한, 지방 재생능을 향상시키기 위해 지방유래 줄기세포를 스캐폴드에 담지 하여 지방세포의 스캐폴드 내부에서 생존율과 분화능을 가진 다기능성 수화젤 스캐폴드를 설계하였다. 결론적으로 acrylamide, HEMA, poloxamer 407를 포함하는 합성 고분자와 천연 고분자인 알긴산과 같은 다양한 고분자를 활용하여 지방조직 재생 및 재건에 특화된 수화젤 스캐폴드를 합성하였다. 또한, 수화젤 스캐폴드에 지방유래 줄기세포 및 지방조직을 담지 하여 주변 지방조직의 재생을 촉진시키도록 설계하여 기존 연조직 재생과 달리 지방조직 재생 메커니즘의 특성과 물성에 최적화된 수화젤 스캐폴드를 개발하여 향후 지방조직 공학의 연구의 발전에 기여하였다. 또한, 합성된 수화젤 스캐폴드는 높은 생체 안전성과 생체 내 구조적 안정성을 가지고 생체 내에서 유동적으로 주변조직과 융화되어 자리잡고, 주변 조직의 재생을 유도한다. 이러한 특성으로 본 연구에서 합성된 다기능성 수화젤은 지방조직의 재생 및 재건뿐 만 아니라 다양한 연조직, 생체 분자 전달 시스템, 세포 스캐폴드를 포함하는 응용분야에 적용될 수 있다는 것을 보여주었다.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells cultured at high cell density express brain-derived neurotrophic factor and exert neuroprotective effects in a 6-hydroxydopamine rat model of Parkinson's disease

박준범 Graduate School, Yonsei University 2015 국내박사

Mesenchymal stem cells (MSCs) secrete neurotrophic factors, and have been reported to improve functional outcomes in animal models of neurodegenerative diseases such as cerebral ischemia, stroke, spinal cord lesions, and Parkinson’s disease. Previously, we found that adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ASCs) cultured at high cell density (HD-ASCs) expressed interferon-beta (IFN-β). Here we demonstrate that ASCs expressing IFN-β also express brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Growth rates of neuroblastoma cells (SK-N-BE(2)C) were increased when co-cultured with HD-ASCs or treated with concentrated medium obtained from HD-ASCs (HD-ASC-CM). The HD-ASC-CM induced AKT phosphorylation in SK-N-BE(2)C cells, and AKT inhibition by Ly294002 reduced cell viability of SK-N-BE(2)C cells. Additionally, a protective effect on SK-N-BE(2)C cells exposed to 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was observed in the HD-ASC-CM or brain-derived neurotrophic factor (BDNF) treated cells. The protective effect of the HD-ASC-CM was neutralized by anti-BDNF?antibody. In the 6-OHDA-induced Parkinson’s disease rat model, ASCs reduced amphetamine-induced rotations and a greater number of tyrosine hydroxylase (TH)-positive cells were observed in the HD-ASCs-injected group compared with sham controls and the low density cultured ASC-injected group. Moreover, the expression of BDNF, nerve growth factor (NGF), TH, and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in ipsilateral midbrain tissues including substantia nigra pars compacta (SNc) was increased by transplantation of HD-ASCs. These data indicate that HD-ASCs may induce neuroprotective effects through BDNF expression and subsequent increase of proliferation in neuronal cells both in vitro and in vivo. 중간엽줄기세포가 중간엽줄기세포가 중간엽줄기세포가 향신경 물질을 물질을 분비함으로써 분비함으로써 분비함으로써 , 허혈성 허혈성 뇌졸중 뇌졸중 이나 척수 질 환, 파킨슨씨 파킨슨씨 병과 같은 신경퇴행성 신경퇴행성 신경퇴행성 동물 모델에서 모델에서 모델에서 예후를 예후를 개선 시킨다는 시킨다는 시킨다는 보 고들이 있었 다. 선행 연구에서 연구에서 고농도로 고농도로 배양된 배양된 지방조직 지방조직 유래 중간엽줄기세 중간엽줄기세 포(ASCs) (ASCs)에서 인터페론 인터페론 (IFN) (IFN)(IFN) -β가 발현된다는 발현된다는 발현된다는 것을 보고 하였고 하였고 , 이번 연 구에서 인터페론 인터페론 (IFN)(IFN)(IFN) -β가 BDNF BDNF 를 발현시키는 발현시키는 것을 확인 하였다 . 또한 , 고농도로 배양된 배양된 ASCs 나 ASCs ASCs 배양액 배양액 와 함께 처리된 처리된 신경세포종의 신경세포종의 신경세포종의 성장 속 도가 증가되 증가되 는 것을 관찰 하였다 하였다 . 6-OHDA OHDA에 노출된 신경세포종에서 신경세포종에서 신경세포종에서 고농도 로 배양된 배양된 ASC s 혹은 BDNF 를 함께 처치한 처치한 경우 보호 효과를 관찰 하였고 하였고 , 그러한 효과는 항BDNF BDNF BDNF 항체에 의해 중화되었다 중화되었다 중화되었다 . 6 . 6-OHDAOHDA OHDA를 처치하여 처치하여 만든 파킨슨씨 병 rat rat rat 모델에서 모델에서 모델에서 고농도로 고농도로 배양된 배양된 ASCs ASCs 를 주입한 주입한 군에서는 군에서는 저농도 로 배양된 ASCs ASCs를 주입한 주입한 군이나 군이나 대조군과는 대조군과는 대조군과는 다르게 다르게 암페타민 암페타민 유래 회전의 회전의 감소와 TH 양성 세포의 세포의 증가가 관찰되었다 관찰되었다 관찰되었다 . 고농도로 고농도로 배양된 배양된 ASCs 가 주입된 군에서는 BDNF, NGF, TH, PCNA BDNF, NGF, TH, PCNA BDNF, NGF, TH, PCNA BDNF, NGF, TH, PCNABDNF, NGF, TH, PCNABDNF, NGF, TH, PCNA BDNF, NGF, TH, PCNABDNF, NGF, TH, PCNA BDNF, NGF, TH, PCNABDNF, NGF, TH, PCNA의 발현이 흑질 (SNc) (SNc) 을 포함한 동측 뇌세 포에서 증가됨을 증가됨을 관찰 하였다 . 이러한 결과는 결과는 in vitroin vitroin vitroin vitroin vitro in vitroin vitro와 in vivo in vivoin vivoin vivoin vivoin vivo에서 고농도로 고농도로 배양된 ASCs ASCs가 BDNF BDNF 의 발현을 발현을 통해서 통해서 신경세포의 신경세포의 증식을 증식을 증가 시킴으로써 시킴으로써 시킴으로써 신경보호 효과를 나타 내는 것을 시사한다 시사한다.

Streptozotocin으로 유도된 당뇨성 발기부전 마우스 모델에서 지방조직유래 줄기세포의 효과

뭉크하야르 인하대학교 대학원 2010 국내석사

서론: 일반적으로 당뇨성 발기부전 환자는 심한 내피세포부전을 동반하고, 경구용 phosphodiesterase-5 억제제에 치료반응도가 낮은 경향이 있다. 따라서 음경해면체 내피세포재생은 당뇨성 발기부전에 있어서 유망한 치료전략이 될 것으로 생각된다. 본 연구에서는 당뇨성 발기부전 동물모델에서 지방조직유래 줄기세포 (adipose tissue-derived stromal vascular fraction, AD-SVF)의 효과를 평가하였다. 대상과 방법: AD-SVF는 녹색형광 (green fluorescent protein)을 띈 마우스에서 분리하였다. 당뇨는 생후 8주된 수컷 마우스 (C57BL/6J)에서 streptozotocin (50 mg/kg)을 5일 연속 복강 내 투여함으로써 유발하였고, 당뇨 유도 후 8주째에 실험을 진행하였다. 총 6 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다 (N = 4/군); 1군, 대조군; 2군, 당뇨군 + 비처치군; 3군, 당뇨군 + PBS 투여군; 4군, 당뇨군 + AD-SVF 투여군 (1 × 104 cells/20 ㎕); 5군, 당뇨군 + AD-SVF 투여군 (1 × 105 cells/20 ㎕); 6군, AD-SVF 투여군 (3 × 105 cells/20 ㎕). PBS 및 AD-SVF를 음경해면체 내에 투여 후 2주째에 음경해면체신경자극 후 발기력을 측정하였다. 음경해면체 조직에서 PECAM-1, smooth muscle α-actin에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 내피세포 및 평활근 세포의 양을 정량화 하였다. 또한, AD-SVF (1 × 105 cells/20 ㎕) 주사 후 1, 3, 7일 및 2주 후에 주사한 AD-SVF 세포의 생존율과 음경해면체 내피세포 양의 변화를 측정하였다. 결과: AD-SVF 투여군 중에서 1 × 105 농도에서 가장 놀은 발기력 개선효과를 보였고, 정상 대조군의 82% 정도까지 발기력이 회복되었다. 주사한 AD-SVF 세포는 투여 후 1일 째 가장 높은 발현을 보였다가 이후에는 점차 감소되었고, 투여 후 7일째까지 관찰 되였다. 또한 당뇨군에서 AD-SVF 투여 후 음경해면체 내피세포 양은 1일째부터 증가하였고, 3일과 7일째에 가장 높았다. 비록 투여 후 2주째는 내피세포 양이 감소하는 소견을 보였으나, 내피세포 양이 여전히 정상 대조군과 비슷한 정도로 회복을 보였다. 결론: 본 연구결과로 미루어 AD-SVF를 이용한 음경해면체 내피세포재생은 향후 혈관성 발기부전의 새로운 치료법이 될 것이다.

허혈성 대장염에서 지방유래 줄기세포를 이용한 치료 효과 : Therapeutic effect of adipose-derived stem cells on ischemia induced colitis model in rats

주현호 인제대학교 2012 국내박사

목적 최근 많은 연구에서 줄기 세포를 기반으로 한 세포치료가 허혈성 손상을 입은 생체조직에 빠른 복원효과가 있음을 보여주고 있다. 저자는 쥐를 이용하여 허혈이 유발된 허혈성 대장염 모델에서 지방유래 줄기세포(ASCs)의 치료효과를 확인하고자 본 연구를 수행하였다. 방법 40마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(생후10주, 몸무게 350 ± 20g)를 개복하여 장간막 혈류차단을 통한 허혈성 대장염 모델을 제작한 후 이중맹검법으로 실험군(n = 20)과 대조군(n = 20)으로 나누어 실험을 진행하였다. 허혈성 대장염이 완성된 쥐들에게 수술 3일 후 재개복하여 실험군에게는 ASCs (1 x 10^6 cells)를 thrombin과 fibrinogen 혼합물과 함께 허혈성 병변을 보이는 대장의 장벽에 주입하였다. 대조군에게는 ASCs를 섞지 않은 thrombin과 fibrinogen 혼합물만을 장벽에 주입하였다. 2차 수술 7일 후 재개복하여 육안적으로 유착과 장폐색의 정도를 관찰하였고, 조직학적으로 궤양의 개수와 크기, Wallace ischemic damage score와 미세혈관 밀도를 측정하였고 혈중에서 vascular endothelial growth factor의 농도를 측정하였다. 결과 실험군에서 대조군에 비해 장폐색이 현저히 낮았으며(2.38 ± 0.68 cm versus 2.91 ± 0.78 cm, respectively; p = 0.035), 궤양도 현저히 적은 수로 크기도 작게 발견되었다(0.85 ± 1.63 versus 2.37 ± 2.41, respectively; p = 0.02 and 1.90 ± 2.86 mm versus 6.74 ± 7.61 mm, p = 0.02). Wallace macroscopic and microscopic scores는 실험군에서 대조군보다 낮게 나타났다(1.90 ± 1.22 versus 3.25 ± 1.83, respectively; p = 0.01 and 1.55 ± 1.88 versus 2.84 ± 1.89, p < 0.05). 미세혈관 밀도는 실험군에서 대조군보다 높게 나타났다(54.45 ± 19.45 versus 26.54 ± 13.14, respectively; p = 0.01). 결론 허혈성 손상을 입은 대장벽에 ASCs 의 국소 주입은 혈관 생성을 촉진하여 허혈성 손상의 정도를 감소시키며 조직의 치유를 조장한다. Objectives Many recent studies have indicated that stem cell-based cell therapy can serve as an alternative treatment for repair of ischemic injured tissues. The author examined the therapeutic effects of adipose-derived stem cells (ASCs) on ischemia-induced colitis model in rats. Methods Ischemic colitis was established by dividing mesenteric vessels for a segment of colon in 40 male Sprague-Dawley rats (10 weeks old; weight, 350 ± 20g). Three days later, relaparotomy was done and these 40 rats were divided into two groups by double-blind randomization. In ASCs group (n = 20) ASCs (1 x 10^6 cells) were implanted intramurally into the ischemic area using a mixture of fibrinogen and thrombin. In control group (n = 20) only a mixture of fibrinogen and thrombin was injected without ASCs. Seven days after the second operation, relaparotomy was done and the severity of adhesion, degree of ileus, the number and size of the ulcers, Wallace ischemic damage score, microvascular density and vascular endothelial growth factor in blood were measured. Results The degree of ileus was significantly lower in the ASCs group than in the control group (2.38 ± 0.68 cm versus 2.91 ± 0.78 cm, respectively; p = 0.035), and the mucosal ulcerations were significantly fewer and smaller in the ASCs group than in the control group (0.85 ± 1.63 versus 2.37 ± 2.41, respectively; p = 0.02 and 1.90 ± 2.86 mm versus 6.74 ± 7.61 mm, p = 0.02). Wallace macroscopic and microscopic scores were lower in the ASCs group than in the control group (1.90 ± 1.22 versus 3.25 ± 1.83, respectively; p = 0.01 and 1.55 ± 1.88 versus 2.84 ± 1.89, p < 0.05). Microvascular density was higher in the ASCs group than in the control group (54.45 ± 19.45 versus 26.54 ± 13.14, respectively; p = 0.01). Conclusions Local implantation of ASCs into an ischemic injured colonic wall reduced the grade of ischemic injury and enhanced tissue healing by promoting angiogenesis.