누에 혈림프 유래 Storage-protein 2를 이용한 중간엽줄기세포의 동결보존

박지성 인하대학교 대학원 2014 국내석사

줄기세포 치료는 암, 당뇨, 신경질환과 같은 난치병을 치료할 수 있는 장점이 있으며 이에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 중간엽줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)는 윤리적 문제가 없고, 면역거부반응이 적기 때문에 세포 치료제의 자원으로 매우 유용하게 이용된다. 줄기세포 치료제의 개발은 크게 줄기세포의 분리, 동결보존, 배양 및 대량배양의 단계로 나눌 수 있다. 이 중에 세포를 장기간 보관하는 동결보존은 매우 중요한 부분이다. 현재 줄기세포의 동결 보호제로서 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 사용하고 있다. 그러나 FBS는 동물유래 오염원을 유발할 위험이 있으며, 면역거부반응이 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 생산 공정 간 차이로 인해 FBS의 품질이 일정하지 않다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 동결보존시 사용되는 FBS를 대체하고자 누에 혈림프 유래의 storage-protein 2(SP2)를 이용하였다. SP2는 70 kDa의 분자량을 갖는 수용성 단백질로서 누에의 혈림프로부터 얻을 수 있다. SP2는 동물세포의 배양에 있어서 활성 산소의 발생 및 세포 사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 hMSCs의 일종인 탯줄유래 중간엽줄기세포(umbilical-cord-derived mesenchymal stem cells, UC-MSCs)와 지방유래 중간엽줄기세포(adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells, AT-MSCs)를 사용하였다. 90% SP2와 10% DMSO를 혼합한 동결보호제를 이용하였다. 완만동결법(slow-freezing)으로 세포를 동결하였으며 7일간 액체질소에 보관하였다. SP2의 효과를 확인하기 위하여 동결보존시 발생하는 활성산소 및 세포 사멸을 측정하였다. 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도를 결정한 후에 세포를 동결하였다. 동결된 세포를 해동(thawing)하여 hMSCs의 특성을 유지하는지 확인하였다. 그 결과, SP2의 사용은 동결보존시 활성산소의 발생과 세포사멸을 억제했다. 동결보호제에 첨가할 SP2의 농도는 5 mg/mL로 결정하여 세포 동결을 수행하였다. 동결 후에도 hMSCs의 특이적 성질과 분화능력을 지속적으로 유지하는 것을 확인하였다. 결론적으로, SP2는 세포의 변화를 야기하지 않았으며 동결보호제로 사용되는 FBS를 대체할 수 있었다. 본 연구에서는 SP2가 동결보호제로 사용될 수 있는 가능성을 확인하였고, SP2를 이용한 hMSCs의 무혈청 동결보존 방법을 제시하였다.

중간엽 줄기세포 유래 분비체의 치료적 효과에 대한 고찰

박정수 고려대학교 생명환경과학대학원 2019 국내석사

Mesenchymal stem cells (MSC) are a specific cell population defined by their ability to indefinitely self-renew, differentiate into multiple cell lineages, and form clonal cell populations. Recent studies have shown that implanted cells do not survive for long, and that the benefits of MSC therapy could be due to the vast array of secretomes they produce, which play an important role in the regulation of key biologic processes. This protein or “secretome” comprises a diverse host of cytokines, chemokines, angiogenic factors, and growth factors. The autocrine/paracrine role of these molecules is being increasingly recognized as key to the regulation of many physiological processes including directing endogenous and progenitor cells to sites of injury as well as mediating apoptosis, scarring, and tissue revascularization. Many studies suggested that administration of MSC-derived secretomes represents a new, cell-free therapeutic approach for attenuation of inflammatory and degenerative diseases. Therapeutic effects of MSC-derived secretomes relied on their capacity to deliver genetic material, growth and immunomodulatory factors to the target cells resulting in tissue repair and regeneration. While there are a number of hurdles to overcome on road to translation, the MSC secretome holds much potential as a regenerative therapy for many clinical disease. This review provides an overview of our current understanding of MSC secretomes with respect to their potential therapeutic effects, and summarize their functional role, mechanism of action, research methods, clinical applications, and limitations. 줄기세포 연구는 기존에 치료가 되지 않았던 난치병 및 희귀성 질환에 대한 신약개발, 개인 맞춤을 위한 재생의학 등에 활용되고 있으며 다른 기술과 융합하여 다양한 방면으로 진행되고 있다. 그러나 줄기세포를 이용한 연구 분야에 있어서 임상적으로 극복해야 할 문제점이 존재하고 있다. 줄기세포를 만들기 위해 인간 배아줄기세포 등을 이용하게 되면서, 윤리적 문제와 법•제도적인 규제의 문제점이 생겼고, 이러한 한계점을 벗어나기 위해 성체줄기세포를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만 임상에서의 부작용 및 효율성이 낮은 임상 결과에 대한 논란이 지속적으로 제기되어지고 있다. 중간엽 줄기세포는 지방세포, 근육세포, 골세포, 연골세포 등의 중배엽성 세포로 분화하는 능력을 가질 뿐만 아니라 비중배엽성 세포인 신경세포, 췌장내분비세포, 간세포, 혈관내피세포 및 심근세포로도 분화한다. 이러한 분화능력과 중간엽 줄기세포에서 발생되는 분비체인 사이토카인, 케모카인, 혈관형성인자, 성장인자 등에 의해 다양한 생체 효능을 나타내고 있다. 중간엽 줄기세포 분비체는 세포의 성장, 복제, 신호전달, 세포사멸 및 혈관 형성과 같은 생물학적 시스템에 중요한 역할을 하는 물질이다. 중간엽 줄기세포에서 분비된 물질들이 체내에서 줄기세포들이 손상부위에 노출 되었을 때 주변의 미세환경들과 반응을 하여 다양한 치료 단백질을 분비하여 손상부위를 치료하는 주변분비작용(paracrine effect)을 가지고 있다. 이런 분비체의 특징과 치료적 효과를 바탕으로 새로운 치료제 개발을 위한 임상을 포함한 다양한 연구들이 진행되고 있다. 특히 분비체를 이용한 치료 단백질연구는 줄기세포에서 분비되는 분비체만을 이용하여 줄기세포가 치료에 사용되지 않는 안전성 및 환경제어가 가능한 치료이기 때문에 연구재료로써 많은 각광을 받고 있다. 본 논문에서는 이러한 줄기세포의 종류 및 특성에 대하여 알아보고, 그 중 중간엽 줄기세포에서 분비되는 분비체의 작용 기전, 기능적 역할, 연구방법 및 임상치료 분야로의 적용, 그리고 분비체 연구의 문제점에 대해서 정리하였다.

Sphingosine 1-phosphate가 BALB/c 마우스 골수유래 중간엽줄기세포의 이동성과 침윤성에 미치는 영향 연구

김정희 인하대학교 대학원 2015 국내석사

골수유래 성체줄기세포의 노화에 따른 내인성 대사체 발현 연구

이슬지 서울대학교 대학원 2014 국내박사

중간엽줄기세포는 제한된 증식력을 가지고 있어 암세포화 가능성이 없으며 윤리적으로 문제가 되지 않아 연구 및 임상에 다양하게 이용되고 있다. 그러나 개체로부터 얻을 수 있는 수가 적어 필연적으로 체외(in vitro)에서 증폭이 요구되며 이 과정에서 줄기세포의 특징을 유지하는 고도의 배양 기술이 필요한 점이 응용 단계에서의 한계로 지적되어 왔다. 이에 따라 본 연구는 체외 배양 과정에서 중간엽줄기세포의 분화능과 활성 변화를 확인하고 조절하는 기술을 확보하기 위하여 수행되었다. 배양 중 노화에 따른 줄기세포 특성 변화를 확인할 지표물질(marker)를 선별하기 위하여 사람 골수유래 클론성 중간엽줄기세포(human bone marrow–derived clonal mesenchymal stem cell)의 세포 노화(cellular senescence)를 유도하여 발현이 변화하는 내인성 대사체를 UPLC/Q-TOFMS를 기반으로 확인하였다. 검출된 대사체 중 후보지표물질(marker candidate)을 선별하기 위하여 linear mixed effects model을 적용하여 배치(batch)와 시간(passage)의 영향을 보정하였으며 t-test와 F-test를 이용하여 평균과 분산에 대한 검정을 각각 수행하였다. 선별된 후보지표물질의 동정을 위하여 대표적인 표준품과 충돌에너지(collision energy)에 따른 스펙트럼 패턴을 통해 구조 분석을 한 결과, 노화에 따라 발현이 변화하는 대사체가 몇몇 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)과 라이소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine) 임을 동정하였다. 본 연구를 통하여, 중간엽줄기세포가 노화될 때에 발현이 변화하는 내인성 대사체를 확인하였고 이의 기전에 대한 가설을 제시하였다. 이는 중간엽줄기세포의 노화의 진행을 확인하는 지표물질로 이용할 수 있을 뿐만 아니라 노화의 과정이 세포내의 어떤 기전과 연관되는지를 이해하는 데에 이용될 수 있다.

셀레노시스테인과 소디움 피루빈산염이 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 노화에 미치는 영향

이은비 순천향대학교 대학원 2018 국내석사

줄기세포는 자기 재생과 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 것으로 알려져있다. 그 중 인간 중간엽줄기세포는 성체줄기세포의 한 종류로 세포로 분화 가 가능한 다분화능을 가진다. 이 세포는 제대혈, 골수, 지방 조직, 골격근, 그리고 말초혈액에서 추출이 가능하다. 현재까지 인간 중간엽줄기세포는 많은 임상 시험에 적용 되어 왔고, 세포치료제로써의 가능성이 높게 평가되고 있 다. 하지만 인간 중간엽줄기세포를 실제 세포 치료제로 상용화하기 위해서는 일정한 세포의 수를 얻는 것이 중요하다. 이를 위하여 세포를 in vitro에서 여러 계대에서 배양하게 되는데, 이때 세포는 복제적 노화를 겪게 되고, 그 기능이 떨어지게 된다. 세포가 노화를 겪게 되면 세포 내 활성산소종의 증가와 생존, 증식 능력이 감소한다. 이러한 제한으로 인해 본 연구에서는 노화가 진행된 세포 내의 활성산소종의 수준을 감소시키고, 세포의 증식과 생존 능력을 증가시킬 수 있는 물질을 찾는 것을 목표로 하였다. 그 결과 셀레노시스테인과 소디움 피루빈산염을 노화가 진행된 인간 지방유래 중간엽줄기세포에 처리 하였을 때 세포 내의 활성산소종의 감소와 생존, 증식 능력을 증가 시키는데 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인하였다. 또한, 전령RNA 발현 수준을 확인하는 실험을 통해 세포노화 관련 유전자, 활성산소종 관련 유전자, 그리고 25 종의 인간 셀레노 단백질 유전자의 발현에 두 가지 물질이 미치는 영향을 확인했다. 그 결과 셀레노시스테인과 소디움 피루빈산염은 노화가 진행된 인간 중간엽줄기세포에 활성산소종 수준을 억제하고 증식을 유도하는데 긍정적인 영향이 있다.

인간태반 유래 중간엽 줄기세포의 고효율 분리, 생산에 관한 연구

신영재 고려대학교 의학전문대학원 2017 국내석사

목적: 정상 분만과정에서 적출물로 폐기되는 인간태반 내측 융모막으로부터 배양생산된 중간엽줄기세포의 특징을 인간 골수유래 중간엽줄기세포와 비교 분석함으로써 인간태반 중간엽줄기세포 고유의 특상을 파악하고자 함. 방법: - 본 연구에 이용할 인간태반 중간엽줄기세포 및 인간골수 중간엽줄기세포는 고려대학교 줄기세포 연구소에 보관되어 있는 세포주(cell line)들을 이용함. 이 세포주는 2006년도에 고려대학교 안암병원 IRB 승인(승인번호: AN09085-011) 하에 산모로부터 기증받은 태반과 정상 골수공여자로부터 기증받은 골수를 이용하여 수립되었음. - 인간태반 중간엽줄기세포의 생산과정은 기존에 수립되어 있는 프로토콜(Genbacev et al, Fertil Steril 2005)에 근거함. - 인간태반 중간엽줄기세포와 인간골수 중간업줄기세포의 줄기세포 표지자 발현 및 증식능과 분화능을 측정하여 비교분석함. 결론: - 태반은 임신 주수와 관계없이 중간엽 줄기세포의 공급원이며 특히 융모판막이 유용함. - 임신 초기의 태반은 전분화능 줄기세포에서 발현되는 표지자를 발현함으로써 보다 원시적인 특징을 지니고 있음. - 태반 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포와 동등한 증식능을 지니고 있으며, 골수에 비하여 상당히 획득이 용이한 측면을 고려할 때 골수보다 유용한 중간엽 줄기세포 공급원으로 판단됨. - 인간 태반에서 중간엽 줄기세포를 분리할 때 육안 식별에 의한 물리적 방법 효소에 의한 화학적 방법보다 효율성이 높음.

인간 유래 중간엽줄기세포의 특성 및 면역조절 기능에 대한 연구

장인근 아주대학교 일반대학원 2010 국내박사

중간엽줄기세포는 처음에는 골수 내에만 존재하는 것으로 알려져 왔으나 최근 많은 연구와 실험을 통해 그 외 다양한 성체조직에서도 분리배양이 가능하게 되었다. 중간엽줄기세포는 연골세포, 지방세포, 골세포, 신경세포 등 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력 외에도 면역조절 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 골수, 지방조직, 제대혈, 탯줄의 Wharton's jelly에서 유래된 중간엽줄기세포의 특성 및 면역조절능력을 비교하였고, 면역조절에 관여하는 인자의 기작을 확인하여 향후 면역질환의 치료에 있어서의 임상적 유용성을 가늠할 수 있는 기초 자료를 확보하고자 하였다. 골수, 지방조직, 제대혈, 탯줄의 Wharton's jelly에서 모두 성공적으로 중간엽줄기세포의 배양이 가능하였고, 중간엽줄기세포의 조건인 세포모양, 분화능력, 세포표현형을 모두 만족하였다. 중간엽줄기세포가 분비하는 사이토카인, 케모카인, 성장인자를 분석한 결과, 전체적으로 비슷하였으나, IL-12(p40), CCL5, CXCL8 PDGF-AA, VEGF의 분비가 다르게 나타났다. 중간엽줄기세포 자체는 면역반응을 유도하지 않았으며, 동종 말초혈액단핵구나 PHA를 이용한 면역세포 자극시 중간엽줄기세포의 양이 많을수록 면역억제반응이 강하게 나타났고, 면역 반응시 배양 배지내의 IFN-γ와 TNF-α의 양도 시간에 따라 중간엽줄기세포가 없는 대조군에 비해 증가폭이 감소하였다. 또한 transwell system을 이용하여 soluble factor가 면역억제에 주요하게 관여한다는 사실을 알 수 있었다. 중간엽줄기세포에서 IFN-γ에 의해 발현되는 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)는 T 세포 증식에 필수적인 tryptophan을 분해하여 면역 억제를 유도한다. 면역세포 증식 실험시 anti-IFN-γ를 처리하거나, tryptophan을 첨가하여 면역세포의 증식이 회복되는 결과를 통해서 중간엽줄기세포의 T 세포 증식억제에 IFN-γ와 IDO가 관여한다는 사실을 증명하였다. 또한 중간엽줄기세포에 IFN-γ를 처리하였을 때 세포내 신호전달물질을 확인한 결과 STAT1과 IRF-1이 IDO 발현과 밀접한 관계가 있었다. 중간엽줄기세포에서 IDO 발현을 위한 IFN-γ의 농도와 IDO 발현 시간 및 발현 유지 시간 등을 mRNA와 단백질 분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과를 바탕으로 IFN-γ 1 IU/ml를 24시간 동안 처리한 중간엽줄기세포와 처리하지 않은 세포를 이용하여 면역반응을 살펴본 결과, IFN-γ를 처리한 중간엽줄기세포의 면역세포 증식억제 효과가 더 강하게 나타났다. 네 가지 조직 유래 중간엽줄기세포 모두 효과적으로 면역세포의 증식을 억제하였으며, IDO의 발현 증가가 면역억제 기전에 공통적으로 관여하는 것을 확인하였다. 향후 골수 채취에 비해 덜 침습적인 지방조직이나 비침습적인 방법으로 수득한 제대혈 또는 탯줄의 중간엽줄기세포를 면역질환 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대된다. Although mesenchymal stem cells (MSCs) were originally isolated from bone marrow, similar populations have been reported in other tissues. MSCsare capable of giving rise to multiple lineages such as chondrocytes,adiocytes, osteoblasts and neurons. Additionally, MSCs are recently knownto have immunoregulatory function. The purpose of this study was to obtain basic data on the characterization, immunomodulatory fuctions and immunomodulatory mechanism of MSCs obtained from bone marrow(BM),adipose tissue(AT), umbilical cord(Wharton's jelly; WJ) and umblical cord blood(CB), which might be useful in treating various immunologic diseases in the future. The author compared four types of MSCs about the differentiation potentials, immunophenotype, secretory properties of MSCs. The immunosuppressive effect of MSCs on phytohemagglutinin (PHA)-induced T cell proliferation or mixed leukocyte reaction was analyzed, and then secretory properties were determined. The expression of immunomodulatory factor, expecially IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) mRNA and protein was analyzed. The expression pattern of IDO and intracellular signaling pathway were analyzed after treatment of MSCs with INF-r. Aslo the author analyzed whether the immune response was restored by adding anti-IFN-γ or tryptophan to co-culture of PHA-induced T cells and MSCs or not. The immunosuppressive effect of MSCs pre-treated with IFN-γ on PHA-induced T cell proliferation was analyzed. In brief, MSCs were successfully isolated and expanded from each tissue, and they had similar spindle-shaped morphology, differentiation potentials and immunophenotypes. Secretory factors from each MSC were similarly produced except for IL-12(p40), CCL5, CXCL8, PDGF-AA and VEGF. All of MSCs did not trigger the T cell proliferation. MSCs could suppress the proliferation of stimulated T cells in a dose-dependent manner. In the transwell system, the T cell inhibitory effect was partially reduced but not abolished. It suggests that the immunosuppressive effect of MSCs is partially mediated by soluble factors. When PHA-activated T cells were cocultured with MSCs, the secretion levels of IFN-γ and TNF-α significantly decreased along with reaction time. When MSCs were stimulated with IFN-γ, IDO expression increased in a time-dependant manner and intracellular signals such as STAT1 and IRF-1 were expressed in the same pattern with IDO. Treatment with anti-IFN-γ or tryptophan restored the immune response resulting in PHA-induced T cell proliferation. MSCs pre-treated with IFN-γ inhibited strongly PHA-induced T cell proliferation. In conclusion, MSCs from BM, AT, CB, and WJ had immunoregulatory effects with similar pattern, and an upregulation of IDO expression seemed to be involved in the common mechanism of these immunosuppressive effects of various MSCs. AT or CB/WJ that can be obtained from less invasive or noninvasive methods might be substituted for bone marrow to treat various immunologic diseases in the near future.

뇌졸중동물모델에서 중간엽줄기세포의 치료효과 규명 : Verification of Therapeutic Efficacy of Neural-Induced Mesenchymal Stem Cells in Animal Stroke Model

유승완 아주대학교 대학원 2008 국내박사

Mesenchymal stem cells (MSCs) secrete bioactive factors that exert diverse responses in vivo. In PART I, it was explored mechanism how MSCs may lead to higher functional recovery in the animal stroke model. Bone marrow-derived MSCs were transplanted into the brain parenchyma 3 days after induction of stroke by occluding middle cerebral artery for 2 hours. Stoke induced proliferation of resident neural stem cells in subventricular zone. However, most of new born cells underwent cell death and had a limited impact on functional recovery after stroke. Transplantation of MSCs enhanced proliferation of endogenous neural stem cells while suppressing the cell death of newly generated cells. Thereby, newborn cells migrated toward ischemic territory and differentiated in ischemic boundaries into DCX+ neuroblasts at higher rates in animals with MSCs compared to PBS group. The present study indicates that therapeutic effects of MSCs is at least partly ascribed to dual functions of MSCs by enhancing endogenous neurogenesis and protecting newborn cells from deleterious environment. The results reinforce the prospects clinical application using MSCs in the treatment of neurological disorders. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been shown to ameliorate a variety of neurological dysfunctions. This effect is believed to be mediated by their paracrine functions, since these cells rarely differentiate into neuronal cells. It is of clinical interest whether neural induction of MSCs is beneficial for the replacement therapy of neurological diseases. In PART II, it was been reported that expression of Neurogenin1 (Ngn1), a proneural gene that directs neuronal differentiation of progenitor cells during development, is sufficient to convert the mesodermal cell fate of MSCs into a neuronal one. Importantly, transplantation of Ngn1-expressing MSCs in the animal stroke model dramatically improved motor functions compared to the parental MSCs. MSCs with Ngn1 populated the ischemic brain where they expressed mature neuronal markers including MAP2, NF200, and VGLUT2; and functionally connected to host neurons. MSCs with and without Ngn1 were indistinguishable in reducing the numbers of Iba1+, ED1+ inflammatory cells or TUNEL+ apoptotic cells or in increasing the numbers of proliferating Ki67+ cells. The data indicate that in addition to the intrinsic paracrine functions of MSCs, motor dysfunctions were remarkably improved by MSCs able to transdifferentiate into neuronal cells. Thus, neural induction of MSCs is advantageous for the treatment of neurological dysfunctions. 중간엽줄기세포는 골수등의 장기에서 채취할 수 있으며, 같은 배엽성 세포인 중간엽성 세포로 분화할 수 있는 능력 외에도 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이러한 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 이용하여 뇌졸중을 비롯한 여러 신경계질환에서 세포치료제로 이용될 수 있다. PART I 에서 중간엽줄기세포가 여러 생리활성 물질을 분비할 수 있는 능력을 가지고 있다는 사실에 입각하여 뇌졸중 동물모델에 적용하여 그 치료효과를 확인하였다. 뇌졸중 유도 3 일 후에 중간엽줄기세포를 대뇌주입방법으로 이식하고, subventricular zone 에 존재하고 있는 신경줄기세포의 증식능력을 bromodeoxyuridine 을 복강내 주입하여 확인해보았다. 대조군인 PBS 를 주입하였을 경우, 대부분의 세로 생성된 신경세포가 apoptotic cell death 로 사멸하여, 매우 제한된 정도의 치료효과를 갖고오는데 반해, 중간엽줄기세포를 이식하였을 경우, subventricular zone 에서 신경줄시세포의 분열이 촉진되는 한편, 새로 생성된 신경세포의 세포사멸이 억제되어, 따라서 ischemic territory 쪽으로 새로 생성된 신경모세포가 이동하여 신경세포로 분화하는 양이 증가한다는 것을 확인하였다. 결국, 뇌졸중 동물모델에 중간엽줄기세포를 이식하였을 때, 그 치료효과가 나타나는 것은 이식된 중간엽줄기세포에 의해 신경줄기세포의 분열 및 보호가 촉진되어 그 효과가 나타난다고 할 수 있다. 하지만, 중간엽줄기세포의 중요한 특징 중 한가지인 신경세포로의 분화능은 본 연구에서 확인할 수 없었다. 이것은 이식된 세포가 뇌졸중 동물모델에서 생존할 수 있는 생존율이 매우 떨어지고, 신경세포로의 분화능도 매우 떨어진다는 것을 의미한다. PART II 에서는 이러한 중간엽줄기세포의 제한된 치료효능을 극복하고자, 신경계에서 신경줄기세포로부터 신경세포로의 분화를 촉진하는 전사인자인 Neurogenin1 을 중간엽줄기세포에 도입하여 뇌졸중 동물모델에서 그 치료효능을 살펴보았다. 중간엽줄기세포에 retrovirus 를 이용하여 Neurogenin1 을 도입하고, 그 치료효능을 확인해 본 결과, 중간엽줄기세포에 비해 그 치료효과가 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다. 중간엽줄기세포가 뇌졸중 동물모델에서 세포의 생존률이 매우 떨어지고, 그 분화능도 astrocyte 계열로 대부분 분화하는 것에 반해, Neurogenin1 이 도입된 중간엽줄기세포의 경우, 생존률이 매우 뛰어나고, 그 분화능도 대부분, 신경세포로 분화하고, 또한 VGLUT2 양성인 glutamatergic 신경세포로 분화하는 것을 확인하였다. 또한 Neurogenin1 이 도입된 중간엽줄기세포의 경우 host 의 신경세포와 기능적으로 연결되어 있는 것을 확인함으로써 이 신경세포는 기능적으로 성숙한 신경세포임을 확인하였다. 또한 중간엽줄기세포가 가지고 있는 paracrine efffect 인 내재성 신경줄기세포의 분열 촉진, 세포사멸 억제, 염증반응 억제 등의 효과를 Neurogenin1 이 도입된 중간엽줄기세포에서도 확인함으로써, 이 세포는 그 모세포인 중간엽줄기세포가 갖고 있는 기본적인 특징은 모두 가지고 있으면서, Neurogenin1 에 의해 신경세포로의 분화능이 촉진됨으로써 뇌졸중 동물모델에서 그 치료효과가 중간엽줄기세포보다 더 뛰어남을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구는 기존의 중간엽줄기세포를 이용한 뇌졸중 치료에 있어서 신경세포로 분화가 유도된 중간엽줄기세포의 경우 더 높은 치료효과를 기대할 수 있다는 사실을 시사한다.

Differentiation of mesenchymal stem cells isolated from various tissues to cardiomyocytes : 다양한 조직에서 분리한 중간엽줄기세포로부터 심근세포의 분화유도

김선영 부산대학교 대학원 2003 국내박사

심근경색은 심근세포의 사망을 초래하여 심근조직을 반흔조직으로 대치하게 된다. 심근세포는 최종분화단계의 세포로 재생이 되지 않으므로 중간엽줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능한 다분화능 세포이며 중간엽줄기세포를 이용한 세포대체치료가 허혈성 심질환치료의 방법으로 대두되고 있다. 그러나, 아직까지 그 효율성이 완전히 확립된 것은 아니다. 중간엽줄기세포는 골수 및 지방조직을 포함한 다양한 조직에서 분리가 가능하나 서로 다른 조직에서 분리된 중간엽줄기세포가 서로 다른 분화능을 가지는 지는 불분명하다. 본 연구의 목적은 지방조직, 신생생쥐 심장 및 골격근에서 중간엽줄기세포를 분리하고 이를 5-azacytidine을 이용하여 심근세포로 분화유도하여 분화능을 비교함을 목적으로 하였다. 중간엽줄기세포는 인체지방조직 및 신생생쥐 심장과 골격근에서 분리하여 α-MEM 및 MCDB배지에서 배양하였다. 배양후 세포의 표현형을 flow cytometer로 분석하고 지방세포 및 골세포로의 분화능을 평가하였다. 중간엽줄기세포를 5-azacytidine을 처리하여 위상차현미경으로 분화정도를 평가하고 RT-PCR로 분화표식자의 발현을 조사하였다. 인체지방조직, 신생생쥐의 심근 및 골격근에서 중간엽줄기세포의 분리배양이 가능하였고 50PD 이상 증식능을 유지하였다. 분리한 중간엽줄기세포는 CD29에 양성반응을, CD14 및 CD45에 음성반응을 나타내었다. 적절한 분화조건에서 그 정도는 다양하였으나 지방세포 및 골세포로 분화가 가능하였다. 5-azacytidine처리 1주후 일부세포의 형태변화가 관찰되었으며 2주후 구형태의 세포집단을 형성하였고 3주후 자발적으로 수축하는 세포로 변화되었다. RT-PCR분석결과 변환된 세포는 myosin heavy chain 및 alpha-actin을 발현하였다. 분화세포는 5-azacytidine처리후 2개월까지 심근세포의 형태를 유지하였으며 그 분화정도는 신생생쥐 심장에서 분리한 중간엽줄기세포에서 가장 높았고 골격근에서 분리한 중간엽줄기세포에서 가장 낮았다. 이상의 결과는 다양한 조직에서 분리한 중간엽줄기세포가 심근세포로 분화가능함을 나타내며 분화정도는 분리한 조직에 따라 달랐다. 분화능의 차이에 대한 분자적 기전의 이해는 중간엽줄기세포를 심근세포로 효율적으로 분화하는 기술개발에 중요한 정보를 제공할 것으로 판단된다. Myocardial infarction results in the death of cardiomyocytes, which are replaced by scar tissue. Cardiomyocytes cannot regenerate because they are terminally differentiated. MSCs are pluripotent progenitors for a variety of cell types, including fibroblasts and muscle cells. Therefore, cell replacement therapy using MSC has been thought as a useful therapeutic method for ischemic heart diseases. However, its effectiveness has not firmly established. MSCs have been reported to be present in various tissues including bone marrow and adipose tissue. However, whether differentiation potential to cardiomyocytes is variable in MSCs obtained from various tissues has not been compared. The aim of this study was to direct differentiation of the MSC isolated from adipose tissues, neonatal cardiac and skeletal muscles into cardiomyocytes using 5-azacytidine and to compare their differentiation potential. MSC were isolated from the human fatty tissue, neonatal cardiac and skeletal muscles and cultured in MCDB medium. At variable time points, we tested cell phenotype by FACS and evaluated their differentiation into adipocytes and osteoblasts in vitro. Their MSC were treated with various concentrations of 5-azacytidine and incubated for different intervals of time. After then, the cells were examined by phase constrast microscope and RT-PCR. MSC could be cultured from adipose tissue, cardiac and skeletal muscle for more than 50 population doublings (PDs) and were positive for CD29, and negative for CD14 and CD45. MSC from the three tissues differentiated to cells with morphologic and phenotypic characteristics of adipocytes and osteocytes. After treatment with 5-azacytidine, the MSC were transformed into cardiomyocytes. At 1 week, some cells showed binucleation and extended cytoplasmic processes with adjacent cells. At 2 weeks, 5% to 25% of the cells increased in size and formed a ball-like appearance. At 3 weeks, these cells began to beat spontaneously in culture when observed under phase contrast microscope. RT-PCR analysis showed that the transformed cells are positive for myosin heavy chain, and alpha actin. The differentiated cells maintained the phenotype and did not dedifferentiate up to 2 months after treatment with 5-azacytidine. The proportion of transformed cells were highest in MSC from neonatal heart, and lowest in MSC from skeletal muscles. These results confirm that MSC isolated from various tissues can be chemically transformed into cardiomyocytes, and their differentiation potential is variable according to the source of cells. Understanding of molecular background for the variability of differentiation potentials will provide informations for designing efficient differentiation protocols of MSCs to cardiomyocytes.

조직공학기법을 이용한 바이오인대 개발에 관한 연구

崔炅玟 동국대학교 대학원 2007 국내석사

Recently the in vitro reconstruction of anterior cruciate ligament (ACL) has been tried using tissue engineering, especially mesenchymal stem cell (MSC) is considered as a good cell source. Mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow appear to be an attractive tool for use in tissue engineering and cell-based therapies due to their multipotent capacity. To support and enhance the in vitro growth and activity of MSCs, the cell culture medium may be supplemented with various proteins and factors to mimic the physiologic environment in which cells optimally proliferate and differentiate. The majority of studies on MSCs have been restricted to the roles of growth factors, cytokines, and hormones. Based on previous reports demonstrating the important roles of additive supplemented with media, we sought to evaluate the effect of essential(EAs)/nonessential(NEAs) amino acids composition and L-ascorbte 2-phosphate (Asc 2-P) concentration on the proliferation and differentiation of MSCs. The results showed that appropriate level of the EA/NEA and Asc 2-P during culture could significantly modulate MSC proliferation and differentiation without causing a deficit in the differentiation capacity of the cells. In this study we also tried to find the effect of mechanical stimulus on the differentiation of bone marrow-derived MSCs into ACL fibroblast-like cell using a cell training bioreactor imposing cyclic mechanical strain whose parameters were 120 min/day, 0.03 Hz, 5% strain. After 2 weeks of culture, MSCs under cyclic strain showed more regularly oriented alignment and lower expression of CD73 and CD105 than control by microscopy and FACS analysis. In transcriptional level, type I collagen, type Ⅲ collagen, fibronectin, elastin, α-smooth muscle actin mRNA expressions of MSCs under cyclic strain were higher than control and similar to native ACL. In that, it is thought that mechanical cyclic strain induced the loss of stemness of MSC, therefore improved the differentiation into ACL fibroblast-like cell. And there are studied that effect of various strength of mechanical stimulation (no stretch, 5-15% strain) on the proliferation and differentiation of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. This result is consistent with the finding that the release of LDH under the mechanical stimulus had no affect on the cells, that the mechanical stimulation did not induced cellular damage. In conclusion, the appropriate level of mechanical stimulation (5% strain, 1Hz) served as a potent positive modulator in the proliferation of MSCs at short-turn culture and the mechanical stimulation also could be modulator on differentiation. Mechanical stretch did not induce the release of LDH of MSCs during differentiation culture but mRNA expression of ACL cells’ major extracellular matrix component molecules of MSCs was induced all experiment group. In that there did not differ from control (no stretch). It is supposed that chemical stimulation through medium, growth factors, cytokines etc is superior to mechanical stimulation in MSCs differentiation, although these two stimulations are present at the same time. These results will be very useful in the production of MSC-based cell therapy products for use in the field of tissue engineering and regenerative medicine. 최근에는 조직공학기법을 이용하여 전방 십자인대의 체외재건이 시도되고 있으며 특히 중간엽줄기세포는 이를 위한 좋은 세포원이다. 골수 내에 존재하는 중간엽줄기세포는 특별한 배양 및 분화 환경에서 다양한 세포로 분화할 수 있는 가능성을 지니고 있으며, 중간엽줄기세포를 원하는 조직의 세포로 분화유도하기 위해서는 인체와 유사한 배양환경을 제공하는 스캐폴드, 분화에 필요한 성장인자 및 싸이토카인 등이 첨가된 특정 분화배지의 확립, 그리고 인대세포 분화유도를 위한 최적화된 기계적인 자극(응력/변형)을 주는 생물반응기 등을 모두 만족시켜야 한다. 또한 중간엽줄기세포를 조직공학 및 세포치료에 이용하기 위해서는 많은 수의 세포가 필요하므로 단시간에 대량 배양되어야 한다. 중간엽줄기세포의 증식을 촉진하기 위해 성장인자 등을 이용할 수 있으나 배양도중 골, 연골, 지방 등 다른 조직의 세포로 분화되는 문제점이 있어 본 연구에서는 필수/비필수아미노산 조성과 아스코르빈산 2-인산을 이용하여 분화되지 않고 세포성장을 촉진시키고자 한다. 실험 결과 2배의 필수/비필수 아미노산과 250 μM 미만의 아스코르빈산 2-인산의 첨가는 세포 손상 없이 성장을 향상시키며 분화능력이 유지되고 있음을 확인하였다. 세포 배양시 화학적 요소뿐만 아니라 기계적 요소 또한 세포 반응에 중요한 역할을 한다. 그러므로 중간엽줄기세포를 인대세포로 분화시키기 위해서 화학적 요소뿐만 아니라 기계적 요소 또한 고려해야 한다. 먼저 기계적 자극이 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위해 기본배지와 세포신축 훈련배양기를 이용하여 분화를 유도한 결과 중간엽줄기세포의 표현형이 바뀌어 가는 것을 확인하였으며 인대세포에 많이 발현하는 세포외기질인 제1형 콜라젠, 제 3형 콜라젠, 파이브로넥틴, 엘라스틴, 알파-평활근액틴, 비멘틴의 mRNA 발현은 실제 인대조직과 유사하게 발현되었다. 이러한 결과를 볼 때, 세포신축 훈련배양기는 중간엽줄기세포의 증식과 특정 세포로의 분화배양 시 정치배양방법에 비해 효과적임을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 다양한 크기의 기계적 자극이 골수유래 중간엽줄기세포의 증식에 미치는 영향을 평가하였다. 실험에서 적용한 기계적 변형의 주기조건은 0.03Hz 로 유사관련문헌들의 조건보다 상당히 낮으며, 이 낮은 주기 조건에서도 생체외 배양시 중간엽줄기세포의 증식을 향상을 유도했으며, 이러한 조건이라도 장기간 기계적 자극을 가하면 세포의 증식을 저해시키며 세포 표현형 변형을 유도하는 것으로 확인되었다. 또한 중간엽줄기세포를 전방 십자인대세포로 분화유도를 위해서 적절한 분화 배지와 생물반응기를 통한 훈련배양 환경을 고루 만족시켜야 하므로 본 연구에서는 체외에서 골수유래 중간엽줄기세포를 유사-섬유모세포 분화용 배지와 세포신축 훈련배양기를 이용하여 유사-섬유모세포로 분화를 유도하였는데 이때 다양한 크기의 기계적 자극이 중간엽줄기세포의 분화에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과 모든 실험군에서 인대세포에 많이 발현하는 세포외기질인 제1형 콜라젠, 제 3형 콜라젠, 파이브로넥틴, 엘라스틴, 알파-평활근액틴, 비멘틴의 mRNA 발현이 유도되었으며 이는 화학적 요소와 기계적 자극이 동시에 적용될 경우 기계적 자극보다는 화학적 요소의 작용을 더 크게 받는 것으로 판단된다. 이 결과는 다른 조직 및 장기의 세포도 자극이 주어진다면 체외에서 좀 더 효과적인 분화를 유도할 수 있을 것으로 판단되며, 조직공학과 재생의학 분야에서 중간엽줄기세포를 이용한 세포치료제 개발에 유용하게 이용될 것이다.